Den foreliggende protokol beskriver humant inducerede pluripotente stamcelleafledte type 2 alveolære epitellignende celler (iAT2s). Disse celler kan dyrkes som selvfornyende kugler i 3D-kultur eller tilpasses luft-væske-interface (ALI) kultur.
I lungen er det alveolære epitel en fysisk barriere fra miljømæssige stimuli og spiller en væsentlig rolle i homeostase og sygdom. Type 2 alveolære epitelceller (AT2’er) er de fakultative forfædre til det distale lungeepitel. Dysfunktion og skade på AT2’er kan skyldes og bidrage til forskellige lungesygdomme. Forbedret forståelse af AT2-biologi er således afgørende for at forstå lungebiologi og sygdom; primære menneskelige AT2’er er imidlertid generelt vanskelige at isolere og begrænset i udbuddet. For at overvinde disse begrænsninger kan humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte type 2 alveolære epitelceller (iAT2’er) genereres gennem en rettet differentieringsprotokol, der rekapitulerer in vivo lungeudvikling. iAT2’er vokser under feederfrie forhold, deler et transkriptomisk program med humane voksne primære AT2’er og udfører nøglefunktioner i AT2’er såsom produktion, emballering og sekretion af overfladeaktivt stof. Denne protokol beskriver metoderne til opretholdelse af selvfornyende iAT2’er gennem seriel passaging i tredimensionel (3D) kultur eller tilpasning af iAT2’er til luft-væske-interface (ALI) kultur. En enkeltcellesuspension af iAT2’er genereres før plettering i 3D-opløselig kældermembranmatrix (i det følgende benævnt “matrix”), hvor de selv samles i monolagede epitelkugler. iAT2’er i 3D-kultur kan serielt dissocieres i enkeltcellesuspensioner, der skal passeres eller belægges i 2D ALI-kultur. I ALI-kulturen danner iAT2’er et polariseret monolag med den apikale overflade udsat for luft, hvilket gør denne platform let modtagelig for miljøeksponeringer. Derfor genererer denne protokol en uudtømmelig forsyning af iAT2’er, der producerer op mod 1 x 1030 celler pr. Inputcelle over 15 passager, samtidig med at AT2-programmet angivet med SFTPCtdTomato-ekspression opretholdes. De resulterende celler repræsenterer en reproducerbar og relevant platform, der kan anvendes til at studere genetiske mutationer, modellere miljøeksponeringer eller screene lægemidler.
I lungen er luftvejene og alveolære epitelceller de første til at støde på inhalerede miljøeksponeringer, herunder patogener, der overføres via inhalerede aerosoler og skadelige stimuli såsom cigaretrøg. Type 2 alveolære epitelceller (AT2’er) er afgørende for at opretholde lungehomeostase, da de er de fakultative forfædre til det distale lungeepitel, producerer overfladeaktive stoffer for at lindre alveolær overfladespænding og monterer det medfødte immunrespons på inhalerede eksponeringer 1,2. Imidlertid kan AT2-dysfunktion skyldes lungeskader eller mutationer i gener, der selektivt udtrykkes i AT2’er, såsom SFTPC, SFTPB og ABCA3 3,4,5. Tidligere tilgange til at studere disse genetiske mutationer har været afhængige af musemodeller6 eller konstruerede, mutationsholdige vektorer indført i udødeliggjorte cellelinjer7. Derfor er der behov for platforme, der kan modellere virkningerne af genetiske og miljømæssige forstyrrelser på AT2’er i de fysiologisk relevante celletyper og i et produktivt in vitro-system, for yderligere at forstå den rolle, AT2’er spiller for sundhed og sygdom.
Med hensyn til modellering af luftbårne eksponeringer er luft-væske-grænseflade (ALI) kulturer af primære luftvejsepitelceller med succes blevet anvendt til at afsløre vigtige molekylære reaktioner på cigaretrøg8 og til at modellere luftvejsinfektion 9,10. Et sammenligneligt ALI-kultursystem for det alveolære epitel, et centralt sted for infektion eller skade i sygdom, er meget mindre udviklet sammenlignet med luftvejsepitelmodelsystemet. Udødeliggjorte cellelinjer er blevet dyrket hos ALI som en proxy for det alveolære epitel 11,12, men disse cellelinjer er transkriptomisk forskellige fra primære alveolære epitelceller13 og mangler vigtige cellulære maskiner, såsom evnen til at udskille overfladeaktive stoffer eller danne tætte kryds ved ALI12. Primære humane AT2’er kan dyrkes i 3D-sfærer i nærvær af fibroblaster 1,14, men er underlagt begrænsninger, herunder den begrænsede tilgængelighed fra eksplanterende lunger og deres tendens til at senesce eller miste cellulær fænotype i de fleste kulturer til dato. Disse karakteristika udgør hindringer for den udbredte vedtagelse af primære AT2 in vitro-undersøgelser, selv om der for nylig er gjort fremskridt med at optimere feederfrie 3D-kulturer til udvidelse af primære AT2’er 15,16,17,18.
Der er udviklet direkte differentieringsprotokoller til at rekapitulere in vivo-udviklingsmæssige milepæle for at generere humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte type 2-alveolære epitelceller (iAT2s)19. iAT2’er vokser som selvfornyende kugler i 3D-serumfri kultur i et defineret medium indeholdende CHIR99021, KGF, dexamethason, cAMP og 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), betegnet “CK + DCI”19, i mangel af fibroblastfødere og kan dyrkes i >20 passager20,21. Desuden deler iAT2’er et transkriptomisk program med humane voksne primære AT2’er, danner lamellære kroppe og producerer og pakker overfladeaktivt stof 19,21,22. Denne protokol beskriver den serielle passaging af iAT2’er ved at adskille cellerne til en enkeltcellesuspension. På dette tidspunkt kan iAT2’er omplades og udvides yderligere i 3D-kultur eller belægges i 2D ALI-kultur23. Disse metoder kan bruges til at studere AT2’ernes iboende biologi i homeostase og sygdom 20,22 og til at forhøre virkningerne af forbindelser eller stimuli i en skalerbar, fysiologisk relevant platform 23,24, som det tidligere er blevet vist.
AT2’er opretholder lungehomeostase, og dysfunktion af disse vigtige alveolære celler kan både forårsage og skyldes forskellige lungesygdomme. På grund af vanskeligheden ved at få adgang til og isolere primære menneskelige AT2’er genereres iAT2’er. Ved at anvende de rettede differentieringsmetoder, der er beskrevet andetsteds25 , og den udvidelse og cellesåning, der er beskrevet her, kan iPSC’er, der genereres fra ethvert individ, differentieres til robust selvfornyende iAT2’er og dermed tilvejebringe patientspecifikke celler til biomedicinsk forskning, herunder grundlæggende biomedicinske forskningsudviklingsundersøgelser, sygdomsmodellering, cellebaserede terapier eller lægemiddelskærme. Den nuværende protokol beskriver en metode til dissociering af iAT2’er til en enkeltcellesuspension, som derefter kan omplades i 3D Matrigel for at generere alveolosfærer til celleudvidelse eller omplades i 2D ALI-kultur til yderligere eksperimenter.
Protokollen har flere kritiske trin for at sikre vellykket passaging og replating i både 3D- og ALI-kulturer. Mekanisk trituration skal minimeres, da overdreven pipettering kan reducere cellelevedygtigheden. Derudover er såtætheden af iAT2’er i både 3D- og 2D ALI-kulturer kritisk; til 3D-dyrkning er generelt 400 celler / μL 3D Matrigel optimal for de fleste iPSC-linjer. Imidlertid har en række tætheder fra 100-500 celler / μL til tider været vellykkede, og optimering af densiteten kan være nødvendig for forskellige cellelinjer. For ALI-kultur er optimering af såningstætheden af iAT2’er på cellekulturindsatserne også afgørende for at opnå et sammenflydende monolag af celler 48 timer efter såning (dvs. på dagen for luftløftning). Nogle iAT2-linjer kræver flere celler pr. Indsats; således, hvis fejlfinding er påkrævet, anbefales et interval fra 160.000-300.000 celler / indsats til 24-brønds cellekulturindsatser. 3D-kulturer kan også skaleres til 24- og 48-brøndsplader ved at opretholde såtætheden ved 400 celler / μL 3D-matrix og reducere matrixdråbestørrelsen til henholdsvis 25 μL og 20 μL. ALI-kulturer kan skaleres til 96-brønds cellekulturindsatser ved at belægge hver indsats med 30 μL af matrixen, plettere 80.000 celler i 30 μL pr. Indsats og fodre med 150 μL basolaterale medier pr. Brønd. Såningstæthed og matrix- og medievolumener skal skaleres og optimeres i overensstemmelse hermed til andre pladeformater.
En begrænsning af denne protokol er, at de celler, der anvendes til ALI-plettering, skal være tilstrækkeligt rensede til at være NKX2-1+ og SFTPC + 19,20,21,23 til dannelse af iAT2 ALIs, og ALI-kulturdannelse kan variere fra linje til linje. Derudover tillader denne protokol udvidelse og generering af AT2-eneste kulturer, hvilket giver et reduktionistisk modelsystem baseret på en enkelt nøgle alveolær celletype. Det er vigtigt, at andre relevante alveolære celletyper, såsom alveolære type 1-celler, manglede fra disse platforme. Andre grupper har haft succes med at dyrke primære menneskelige AT2’er som sfæroider eller organotypiske kulturer med eller uden fibroblaster 1,14,15,16,17; Imidlertid har primære menneskelige AT2’er en tendens til at miste deres udtryk for vigtige overfladeaktive stoffer, når de dyrkes i normal 2D-kultur uden ALI-betingelser26. Desuden har nyere arbejde vist, at iAT2’er udtrykker højere proliferative markører og lavere AT2-modningsmarkører end friske, ukultiveret menneskelige primære AT2’er27. På trods af disse forskelle mellem iAT2’er og friske primære humane AT2’er fandt vi, at selv dyrkede primære AT2’er viste transkriptomiske forskelle fra friske, ukultiverede primære AT2’er27 og konkluderer således, at disse in vitro-modeller har forskellige styrker og begrænsninger for modellering in vivo lungebiologi.
iAT2-platformen kan anvendes til at studere genetiske mutationer fra patientafledte iPSC’er19,20. Systemet kan også opskaleres væsentligt for at imødekomme screening af lægemidler med høj kapacitet. Derudover er iAT2 AL’er egnede til miljøeksponeringer såsom viral eller bakteriel infektion eller eksponering for cigaretrøg, e-cigaretdamp eller andre aerosoler23. Sammenfattende giver denne protokol til generering af både 3D- og 2D ALI-kulturer af iAT2’er mulighed for langsigtet dyrkning af en sygdomsrelevant celletype og giver en fysiologisk, skalerbar platform, der muliggør brugen af disse celler i mange applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker oprigtigt medlemmer af Wilson-, Kotton- og Hawkins-laboratorierne for deres nyttige diskussioner. Vi er også meget taknemmelige for Greg Miller (CReM Laboratory Manager) og Marianne James (iPSC Core Manager) for deres uvurderlige støtte. Vi takker Brian Tilton og BUMC Flow Cytometry Core for deres tekniske bistand med cellesortering (støttet af NIH-bevilling #1S10OD021587-01A1). Dette arbejde blev støttet af et CJ Martin Early Career Fellowship fra Australian National Health and Medical Research Council tildelt RBW; NIH giver F30HL147426 til KMA; en I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award fra The Pulmonary Fibrosis Foundation og en Integrated Pilot Grant Award gennem Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) til KDA; Swiss National Science Foundation (P2ELP3_191217) til ABA; NIH yder U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til DNK; og NIH yder U01TR001810, R01DK101510 og R01DK117940 tildelt AAW; iPSC vedligeholdelse, bank og deling understøttes af NIH tilskud NO1 75N92020C00005. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |