Het huidige protocol beschrijft door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelachtige cellen (iAT2s). Deze cellen kunnen worden gekweekt als zelfvernieuwende bollen in 3D-cultuur of worden aangepast aan de air-liquid interface (ALI) -cultuur.
In de longen is het alveolaire epitheel een fysieke barrière tegen omgevingsstimuli en speelt het een essentiële rol bij homeostase en ziekte. Type 2 alveolaire epitheelcellen (AT2’s) zijn de facultatieve voorlopers van het distale longepitheel. Disfunctie en letsel van AT2’s kan het gevolg zijn van en bijdragen aan verschillende longziekten. Een beter begrip van at2-biologie is dus van cruciaal belang voor het begrijpen van longbiologie en -ziekte; primaire menselijke AT2’s zijn echter over het algemeen moeilijk te isoleren en beperkt in aanbod. Om deze beperkingen te overwinnen, kunnen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen (iAT2’s) worden gegenereerd via een gericht differentiatieprotocol dat de in vivo longontwikkeling samenvat. iAT2’s groeien in feedervrije omstandigheden, delen een transcriptomisch programma met menselijke volwassen primaire AT2’s en voeren belangrijke functies van AT2’s uit, zoals productie, verpakking en afscheiding van oppervlakteactieve stoffen. Dit protocol beschrijft de methoden voor het handhaven van zelfvernieuwende iAT2’s door seriële passaging in driedimensionale (3D) cultuur of het aanpassen van iAT2’s aan lucht-vloeistof interface (ALI) cultuur. Een eencellige suspensie van iAT2’s wordt gegenereerd voordat ze worden geplateerd in 3D-opgeloste keldermembraanmatrix (hierna “matrix” genoemd), waar ze zichzelf assembleren tot monolagige epitheliale bollen. iAT2’s in 3D-cultuur kunnen serieel worden gedissocieerd in eencellige suspensies om te worden gepasseerd of verguld in 2D ALI-cultuur. In de ALI-cultuur vormen iAT2’s een gepolariseerde monolaag waarbij het apicale oppervlak wordt blootgesteld aan lucht, waardoor dit platform gemakkelijk vatbaar is voor blootstelling aan het milieu. Vandaar dat dit protocol een onuitputtelijke voorraad iAT2’s genereert, die meer dan 1 x 1030 cellen per invoercel produceert over 15 passages met behoud van het AT2-programma dat wordt aangegeven door SFTPCtdTomato-expressie . De resulterende cellen vertegenwoordigen een reproduceerbaar en relevant platform dat kan worden toegepast om genetische mutaties te bestuderen, omgevingsblootstellingen te modelleren of geneesmiddelen te screenen.
In de longen zijn de luchtweg en alveolaire epitheelcellen de eersten die te maken krijgen met inhalatie van blootstelling aan het milieu, waaronder pathogenen die worden overgedragen via ingeademde aerosolen en schadelijke stimuli zoals sigarettenrook. Type 2 alveolaire epitheelcellen (AT2’s) zijn essentieel bij het handhaven van longhomeostase omdat ze de facultatieve voorlopers zijn van het distale longepitheel, oppervlakteactieve stoffen produceren om de alveolaire oppervlaktespanning te verlichten en de aangeboren immuunrespons op geïnhaleerde blootstellingen te verhogen 1,2. AT2-disfunctie kan echter het gevolg zijn van longletsel of mutaties in genen die selectief tot expressie komen in AT2’s, zoals SFTPC, SFTPB en ABCA3 3,4,5. Eerdere benaderingen voor het bestuderen van deze genetische mutaties zijn gebaseerd op muismodellen6 of gemanipuleerde, mutatiebevattende vectoren geïntroduceerd in onsterfelijke cellijnen7. Daarom zijn platforms nodig die de effecten van genetische en omgevingsverstoringen op AT2’s in de fysiologisch relevante celtypen en in een productief in vitro systeem kunnen modelleren om de rol van AT2’s in gezondheid en ziekte verder te begrijpen.
In termen van het modelleren van blootstellingen in de lucht, zijn air-liquid interface (ALI) culturen van primaire luchtwegepitheelcellen met succes gebruikt om belangrijke moleculaire reacties op sigarettenrook8 en op luchtweginfectie 9,10 te onthullen. Een vergelijkbaar ALI-kweeksysteem voor het alveolaire epitheel, een belangrijke plaats van infectie of letsel bij ziekte, is veel minder ontwikkeld in vergelijking met het luchtwegepitheelmodelsysteem. Onsterfelijke cellijnen zijn gekweekt bij ALI als een proxy voor het alveolaire epitheel11,12, maar deze cellijnen zijn transcriptomisch verschillend van primaire alveolaire epitheelcellen13 en missen belangrijke cellulaire machines, zoals het vermogen om oppervlakteactieve stoffen af te scheiden of tight junctions te vormen bij ALI12. Primaire menselijke AT2’s kunnen worden gekweekt in 3D-bollen in de aanwezigheid van fibroblasten1,14, maar zijn onderhevig aan beperkingen, waaronder de beperkte toegankelijkheid van explant longen en hun neiging om te senesce of cellulair fenotype te verliezen in de meeste culturen tot nu toe. Deze kenmerken vormen een belemmering voor de wijdverbreide toepassing van primaire AT2-in vitrostudies, hoewel er recente vooruitgang is geboekt bij het optimaliseren van feedervrije 3D-culturen voor de uitbreiding van primaire AT2’s 15,16,17,18.
Gerichte differentiatieprotocollen zijn ontwikkeld om in vivo ontwikkelingsmijlpalen samen te vatten om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen (iAT2s)19 te genereren. iAT2’s groeien als zelfvernieuwende bollen in 3D-serumvrije cultuur in een gedefinieerd medium met CHIR99021, KGF, dexamethason, cAMP en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), genaamd “CK + DCI”19, in afwezigheid van fibroblastfeeders en kunnen worden gekweekt voor >20 passages20,21. Bovendien delen iAT2’s een transcriptomisch programma met menselijke volwassen primaire AT2’s, vormen ze lamellaire lichamen en produceren en verpakken ze oppervlakteactieve stof 19,21,22. Dit protocol beschrijft de seriële passaging van iAT2’s door de cellen te dissociëren naar een eencellige suspensie. Op dit punt kunnen iAT2’s opnieuw worden geplateerd en verder worden uitgebreid in 3D-cultuur of verguld in 2D ALI-cultuur23. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de intrinsieke biologie van AT2’s in homeostase en ziekte20,22 te bestuderen en om de effecten van verbindingen of stimuli te ondervragen in een schaalbaar, fysiologisch relevant platform23,24, zoals eerder is aangetoond.
AT2’s handhaven longhomeostase en disfunctie van deze belangrijke alveolaire cellen kan zowel oorzaak als gevolg zijn van verschillende longziekten. Vanwege de moeilijkheid om toegang te krijgen tot primaire menselijke AT2’s en deze te isoleren, worden iAT2’s gegenereerd. Door de elders beschreven gerichte differentiatiemethoden toe te passen25 en de hier beschreven expansie en celzaaiing, kunnen iPSC’s die uit elk individu worden gegenereerd, worden gedifferentieerd in robuust zelfvernieuwende iAT2’s, waardoor patiëntspecifieke cellen worden geleverd voor biomedisch onderzoek, inclusief fundamentele biomedische onderzoeksontwikkelingsstudies, ziektemodellering, celgebaseerde therapieën of medicijnscreenings. Het huidige protocol beschrijft een methode voor het dissociëren van iAT2’s naar een eencellige suspensie, die vervolgens opnieuw kan worden geplateerd in 3D Matrigel om alveolospheres te genereren voor celuitbreiding of opnieuw kan worden geplateerd in 2D ALI-cultuur voor verdere experimenten.
Het protocol heeft verschillende kritieke stappen om succesvolle passageing en replating in zowel 3D- als ALI-culturen te garanderen. Mechanische trituratie moet worden geminimaliseerd, omdat overmatig pipetteren de levensvatbaarheid van cellen kan verminderen. Bovendien is de zaaidichtheid van iAT2’s in zowel 3D- als 2D ALI-culturen van cruciaal belang; voor 3D-cultuur is over het algemeen 400 cellen/μL 3D Matrigel optimaal voor de meeste iPSC-lijnen. Een reeks dichtheden van 100-500 cellen / μL is echter soms succesvol geweest en het optimaliseren van de dichtheid kan nodig zijn voor verschillende cellijnen. Voor ALI-cultuur is het optimaliseren van de zaaidichtheid van iAT2’s op de celkweekinzetstukken ook essentieel om 48 uur na het zaaien (d.w.z. op de dag van de luchtlift) een confluente monolaag van cellen te bereiken. Sommige iAT2-lijnen vereisen meer cellen per insert; dus als probleemoplossing vereist is, wordt een bereik van 160.000-300.000 cellen / insert voor 24-well celkweekinzetstukken aanbevolen. 3D-culturen kunnen ook worden geschaald naar 24- en 48-well-platen door de zaaidichtheid op 400 cellen / μL 3D-matrix te houden en de matrixdruppelgrootte te verminderen tot respectievelijk 25 μL en 20 μL. ALI-culturen kunnen worden geschaald naar 96-well celkweekinzetstukken door elke insert te coaten met 30 μL van de matrix, 80.000 cellen in 30 μL per insert te platen en te voeden met 150 μL basolaterale media per put. Seeding-dichtheid en matrix- en mediavolumes moeten dienovereenkomstig worden geschaald en geoptimaliseerd voor andere plaatformaten.
Een beperking van dit protocol is dat de cellen die worden gebruikt voor ALI-plating voldoende moeten worden gezuiverd om NKX2-1 + en SFTPC + 19,20,21,23 te zijn om iAT2-OSI’s te vormen, en ALI-cultuurvorming kan van lijn tot lijn variëren. Bovendien maakt dit protocol uitbreiding en generatie van AT2-only culturen mogelijk, waardoor een reductionistisch modelsysteem wordt geboden op basis van een enkel belangrijk alveolair celtype. Belangrijk is dat andere relevante alveolaire celtypen, zoals alveolaire type 1-cellen, ontbraken op deze platforms. Andere groepen hebben succes gehad met het kweken van primaire menselijke AT2’s als sferoïden of organotypische culturen met of zonder fibroblasten 1,14,15,16,17; primaire menselijke AT2’s hebben echter de neiging om hun expressie van belangrijke oppervlakteactieve stoffen te verliezen wanneer ze worden gekweekt in normale 2D-cultuur zonder ALI-omstandigheden26. Bovendien heeft recent werk aangetoond dat iAT2’s hogere proliferatieve markers en lagere AT2-rijpingsmarkers uitdrukken dan verse, ongecultiveerde menselijke primaire AT2s27. Ondanks deze verschillen tussen iAT2’s en verse primaire menselijke AT2’s, ontdekten we dat zelfs gekweekte primaire AT2’s transcriptomische verschillen vertoonden van verse, niet-gekweekte primaire AT2’s27, en concluderen dus dat deze in vitro modellen verschillende sterke punten en beperkingen hebben voor het modelleren van in vivo longbiologie.
Het iAT2-platform kan worden toegepast om genetische mutaties van patiënt-afgeleide iPSC’s19,20 te bestuderen. Het systeem kan ook aanzienlijk worden opgeschaald om geneesmiddelenscreening met een hoge doorvoer mogelijk te maken. Bovendien zijn iAT2 ALI’s geschikt voor blootstelling aan het milieu, zoals virale of bacteriële infecties of blootstelling aan sigarettenrook, e-sigaretdamp of andere aerosolen23. Kortom, dit protocol voor het genereren van zowel 3D- als 2D ALI-culturen van iAT2’s maakt langdurige kweek van een ziekterelevant celtype mogelijk en biedt een fysiologisch, schaalbaar platform dat het gebruik van deze cellen in vele toepassingen mogelijk maakt.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken de leden van de laboratoria Wilson, Kotton en Hawkins oprecht voor hun nuttige discussies. We zijn ook Greg Miller (CReM Laboratory Manager) en Marianne James (iPSC Core Manager) erg dankbaar voor hun onschatbare steun. We bedanken Brian Tilton en de BUMC Flow Cytometry Core voor hun technische hulp bij het sorteren van cellen (ondersteund door NIH grant #1S10OD021587-01A1). Dit werk werd ondersteund door een CJ Martin Early Career Fellowship van de Australian National Health and Medical Research Council toegekend aan RBW; NIH-subsidie F30HL147426 aan KMA; een I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award van The Pulmonary Fibrosis Foundation en een Integrated Pilot Grant Award via Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) aan KDA; Zwitserse National Science Foundation (P2ELP3_191217) aan ABA; NIH verleent U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 en R01HL095993 aan DNK; en NIH verleent U01TR001810, R01DK101510 en R01DK117940 toegekend aan AAW; iPSC-onderhoud, bankieren en delen worden ondersteund door NIH-subsidie NO1 75N92020C00005. Figuur 1 is gemaakt met behulp van Biorender.com.
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |