Il presente protocollo descrive le cellule staminali pluripotenti derivate dall’uomo di tipo 2 alveolari epiteliali (iAT2s). Queste cellule possono essere coltivate come sfere auto-rinnovanti in coltura 3D o adattate alla coltura di interfaccia aria-liquido (ALI).
Nel polmone, l’epitelio alveolare è una barriera fisica dagli stimoli ambientali e svolge un ruolo essenziale nell’omeostasi e nella malattia. Le cellule epiteliali alveolari di tipo 2 (AT2) sono i progenitori facoltativi dell’epitelio polmonare distale. La disfunzione e le lesioni degli AT2 possono derivare e contribuire a varie malattie polmonari. Una migliore comprensione della biologia AT2 è, quindi, fondamentale per comprendere la biologia polmonare e la malattia; tuttavia, gli AT2 umani primari sono generalmente difficili da isolare e limitati nella fornitura. Per superare queste limitazioni, le cellule epiteliali alveolari di tipo 2 derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) (iAT2s) possono essere generate attraverso un protocollo di differenziazione diretta che ricapitola lo sviluppo polmonare in vivo . Gli iAT2 crescono in condizioni prive di alimentatore, condividono un programma trascrittomico con AT2 primari adulti umani ed eseguono funzioni chiave di AT2 come produzione, confezionamento e secrezione di tensioattivi. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi per mantenere iAT2 auto-rinnovanti attraverso il passaggio seriale in coltura tridimensionale (3D) o l’adattamento di iAT2 alla cultura di interfaccia aria-liquido (ALI). Una sospensione a singola cellula di iAT2s viene generata prima della placcatura in matrice di membrana basale solubilizzata 3D (di seguito denominata “matrice”), dove si auto-assemblano in sfere epiteliali monostrato. IAT2 in coltura 3D possono essere dissociati in serie in sospensioni monocellulari da passare o placcati in coltura ALI 2D. Nella cultura ALI, gli iAT2 formano un monostrato polarizzato con la superficie apicale esposta all’aria, rendendo questa piattaforma facilmente suscettibile di esposizioni ambientali. Quindi, questo protocollo genera una fornitura inesauribile di iAT2, producendo verso l’alto di 1 x 1030 celle per cella di ingresso su 15 passaggi mantenendo il programma AT2 indicato dall’espressione di SFTPCtdTomato . Le cellule risultanti rappresentano una piattaforma riproducibile e pertinente che può essere applicata per studiare mutazioni genetiche, modellare esposizioni ambientali o farmaci da screening.
Nel polmone, le vie aeree e le cellule epiteliali alveolari sono le prime a incontrare esposizioni ambientali inalate, compresi gli agenti patogeni trasmessi tramite aerosol inalati e stimoli nocivi come il fumo di sigaretta. Le cellule epiteliali alveolari di tipo 2 (AT2s) sono essenziali per mantenere l’omeostasi polmonare in quanto sono i progenitori facoltativi dell’epitelio polmonare distale, producono tensioattivi per alleviare la tensione superficiale alveolare e montano la risposta immunitaria innata alle esposizioni inalate 1,2. Tuttavia, la disfunzione AT2 può derivare da lesioni polmonari o mutazioni in geni che sono espressi selettivamente in AT2, come SFTPC, SFTPB e ABCA3 3,4,5. Gli approcci precedenti per lo studio di queste mutazioni genetiche si sono basati su modelli murini6 o vettori ingegnerizzati contenenti mutazioni introdotti in linee cellulari immortalizzate7. Pertanto, sono necessarie piattaforme in grado di modellare gli effetti delle perturbazioni genetiche e ambientali sugli AT2 nei tipi di cellule fisiologicamente rilevanti e in un sistema produttivo in vitro per comprendere ulteriormente il ruolo che gli AT2 svolgono nella salute e nella malattia.
In termini di modellazione delle esposizioni aerodisperse, le colture di interfaccia aria-liquido (ALI) di cellule epiteliali primarie delle vie aeree sono state utilizzate con successo per rivelare risposte molecolari chiave al fumo di sigaretta8 e per modellare l’infezione delle vie aeree 9,10. Un sistema di coltura ALI comparabile per l’epitelio alveolare, un sito chiave di infezione o lesione nella malattia, è molto meno sviluppato rispetto al sistema modello epiteliale delle vie aeree. Le linee cellulari immortalizzate sono state coltivate all’ALI come proxy per l’epitelio alveolare11,12, ma queste linee cellulari sono trascrittomicamente distinte dalle cellule epiteliali alveolari primarie13 e mancano di macchinari cellulari chiave, come la capacità di secernere tensioattivi o formare giunzioni strette ad ALI12. Gli AT2 umani primari possono essere coltivati in sfere 3D in presenza di fibroblasti1,14 ma sono soggetti a limitazioni, tra cui la limitata accessibilità dei polmoni di espianto e la loro tendenza a senescere o perdere fenotipo cellulare nella maggior parte delle culture fino ad oggi. Queste caratteristiche presentano ostacoli all’adozione diffusa di studi primari in vitro at2, sebbene siano stati compiuti recenti progressi nell’ottimizzazione delle colture 3D prive di alimentatore per l’espansione di AT2 primari 15,16,17,18.
Sono stati sviluppati protocolli di differenziazione diretta per ricapitolare le tappe dello sviluppo in vivo per generare cellule epiteliali alveolari di tipo 2 derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC)19. Gli iAT2 crescono come sfere auto-rinnovanti in coltura 3D senza siero in un mezzo definito contenente CHIR99021, KGF, desametasone, cAMP e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), definito “CK + DCI”19, in assenza di alimentatori di fibroblasti e possono essere coltivati per >20 passaggi20,21. Inoltre, gli iAT2 condividono un programma trascrittomico con AT2 primari adulti umani, formano corpi lamellari e producono e confezionano tensioattivi 19,21,22. Questo protocollo descrive in dettaglio il passaggio seriale di iAT2 dissociando le cellule in una sospensione a cella singola. A questo punto, iAT2s può essere replicato ed espanso ulteriormente nella cultura 3D o placcato nella cultura ALI 2D23. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare la biologia intrinseca degli AT2 nell’omeostasi e nella malattia20,22 e per interrogare gli effetti di composti o stimoli in una piattaforma scalabile e fisiologicamente rilevante23,24, come è stato precedentemente dimostrato.
Gli AT2 mantengono l’omeostasi polmonare e la disfunzione di queste cellule alveolari chiave può sia causare che derivare da varie malattie polmonari. A causa della difficoltà di accedere e isolare gli AT2 umani primari, vengono generati iAT2. Applicando i metodi di differenziazione diretta descritti altrove25 e l’espansione e la semina cellulare qui descritte, le iPSC generate da qualsiasi individuo possono essere differenziate in iAT2 robustamente auto-rinnovanti, fornendo così cellule specifiche per il paziente per la ricerca biomedica, compresi studi di sviluppo della ricerca biomedica di base, modellazione delle malattie, terapie cellulari o screening farmacologici. Il presente protocollo descrive un metodo per dissociare iAT2s in una sospensione a singola cellula, che può quindi essere replicata in Matrigel 3D per generare alveolosfere per l’espansione cellulare o riplazionata in coltura ALI 2D per ulteriori esperimenti.
Il protocollo ha diversi passaggi critici per garantire il successo del passaging e del replating in entrambe le colture 3D e ALI. La triturazione meccanica deve essere ridotta al minimo, poiché un pipettaggio eccessivo può ridurre la vitalità cellulare. Inoltre, la densità di semina di iAT2 in entrambe le colture ALI 3D e 2D è fondamentale; per la coltura 3D, in generale, 400 cellule / μL di Matrigel 3D è ottimale per la maggior parte delle linee iPSC. Tuttavia, una gamma di densità da 100-500 celle / μL ha, a volte, avuto successo e l’ottimizzazione della densità può essere necessaria per diverse linee cellulari. Per la coltura ALI, l’ottimizzazione della densità di semina di iAT2 sugli inserti di coltura cellulare è anche essenziale per ottenere un monostrato confluente di cellule 48 ore dopo la semina (cioè il giorno del sollevamento aereo). Alcune linee iAT2 richiedono più celle per inserto; pertanto, se è necessaria la risoluzione dei problemi, si consiglia un intervallo da 160.000 a 300.000 celle/inserto per inserti di colture cellulari a 24 pozzetti. Le colture 3D possono anche essere scalate a piastre a 24 e 48 pozzetti mantenendo la densità di semina a 400 cellule / μL di matrice 3D e riducendo la dimensione delle goccioline della matrice a 25 μL e 20 μL, rispettivamente. Le colture ALI possono essere scalate a inserti di coltura cellulare a 96 pozzetti rivestendo ogni inserto con 30 μL di matrice, placcando 80.000 cellule in 30 μL per inserto e alimentando con 150 μL di mezzi basolaterali per pozzetto. La densità di semina e i volumi di matrice e supporti devono essere scalati e ottimizzati di conseguenza per altri formati di lastre.
Una limitazione di questo protocollo è che le cellule utilizzate per la placcatura ALI devono essere sufficientemente purificate per essere NKX2-1+ e SFTPC+19,20,21,23 per formare IAT2 ALI, e la formazione di colture ALI può variare da linea a linea. Inoltre, questo protocollo consente l’espansione e la generazione di colture solo AT2, fornendo un sistema di modelli riduzionisti basato su un singolo tipo di cellula alveolare chiave. È importante sottolineare che altri tipi di cellule alveolari rilevanti, come le cellule alveolari di tipo 1, mancavano da queste piattaforme. Altri gruppi hanno avuto successo nella coltivazione di AT2 umani primari come sferoidi o colture organotipiche con o senza fibroblasti 1,14,15,16,17; tuttavia, gli AT2 umani primari tendono a perdere la loro espressione di tensioattivi chiave quando coltivati in normali colture 2D senza condizioni ALI26. Inoltre, lavori recenti hanno dimostrato che gli iAT2 esprimono marcatori proliferativi più elevati e marcatori di maturazione AT2 più bassi rispetto agli AT2 primari umani freschi e non coltivati27. Nonostante queste differenze tra iAT2 e AT2 umani primari freschi, abbiamo scoperto che anche gli AT2 primari coltivati mostravano differenze trascrittomiche da AT2 primari freschi e non coltivati27, e quindi concludono che questi modelli in vitro hanno vari punti di forza e limitazioni per la modellazione della biologia polmonare in vivo.
La piattaforma iAT2 può essere applicata per studiare mutazioni genetiche da iPSC derivate dal paziente19,20. Il sistema potrebbe anche essere sostanzialmente scalato per ospitare lo screening dei farmaci ad alto rendimento. Inoltre, gli IA ALI iAT2 sono adatti per esposizioni ambientali come infezioni virali o batteriche o esposizione a fumo di sigaretta, vapore di sigaretta elettronica o altri aerosol23. In sintesi, questo protocollo per la generazione di colture ALI 3D e 2D di iAT2s consente la coltura a lungo termine di un tipo di cellula rilevante per la malattia e fornisce una piattaforma fisiologica e scalabile che consente l’utilizzo di queste cellule in molte applicazioni.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo sinceramente i membri dei laboratori Wilson, Kotton e Hawkins per le loro utili discussioni. Siamo anche molto grati a Greg Miller (CReM Laboratory Manager) e Marianne James (iPSC Core Manager) per il loro inestimabile supporto. Ringraziamo Brian Tilton e il BUMC Flow Cytometry Core per la loro assistenza tecnica con lo smistamento cellulare (supportata dalla sovvenzione NIH #1S10OD021587-01A1). Questo lavoro è stato supportato da una CJ Martin Early Career Fellowship dell’Australian National Health and Medical Research Council assegnata a RBW; NIH concede F30HL147426 a KMA; un I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award dalla Pulmonary Fibrosis Foundation e un Integrated Pilot Grant Award attraverso il Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) a KDA; Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (P2ELP3_191217) all’ABA; NIH concede U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 e R01HL095993 a DNK; e le sovvenzioni NIH U01TR001810, R01DK101510 e R01DK117940 assegnate ad AAW; La manutenzione, l’attività bancaria e la condivisione di iPSC sono supportate dalla sovvenzione NIH NO1 75N92020C00005. La Figura 1 è stata creata utilizzando Biorender.com.
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |