Den nåværende protokollen beskriver menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede type 2 alveolar epitellignende celler (iAT2s). Disse cellene kan dyrkes som selvfornyende sfærer i 3D-kultur eller tilpasses luft-væske grensesnitt (ALI) kultur.
I lungen er alveolar epitelet en fysisk barriere fra miljøstimuli og spiller en viktig rolle i homeostase og sykdom. Type 2 alveolar epitelceller (AT2s) er fakultetets forfedre til det distale lungeepitelet. Dysfunksjon og skade på AT2 kan skyldes og bidra til ulike lungesykdommer. Bedre forståelse av AT2-biologi er dermed avgjørende for å forstå lungebiologi og sykdom; Imidlertid er primære menneskelige AT2-er generelt vanskelig å isolere og begrenset i forsyning. For å overvinne disse begrensningene kan humanindusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledet type 2 alveolar epitelceller (iAT2s) genereres gjennom en rettet differensieringsprotokoll som recapitulates in vivo lungeutvikling. iAT2s vokser i materfrie forhold, deler et transkripsjonsprogram med humane voksne primære AT2-er, og utfører viktige funksjoner i AT2-er som produksjon, emballasje og sekresjon av overflateaktivt middel. Denne protokollen beskriver metodene for å opprettholde selvfornyende iAT2s gjennom seriell passivisering i tredimensjonal (3D) kultur eller tilpasning av iAT2s til luft-væske grensesnitt (ALI) kultur. En encellet suspensjon av iAT2s genereres før plating i 3D-solubilisert kjellermembranmatrise (heretter referert til som “matrise”), hvor de selv monteres i monolayered epitelale sfærer. iAT2s i 3D-kultur kan serialt dissosieres i encellede suspensjoner som skal passeres eller belagt i 2D ALI-kultur. I ALI-kulturen danner iAT2s en polarisert monolayer med den apikale overflaten utsatt for luft, noe som gjør denne plattformen lett egnet for miljøeksponeringer. Derfor genererer denne protokollen en uuttømmelig tilførsel av iAT2s, og produserer oppover 1 x 1030 celler per inndatacelle over 15 passasjer mens du opprettholder AT2-programmet indikert av SFTPCtdTomato-uttrykk . De resulterende cellene representerer en reproduserbar og relevant plattform som kan brukes til å studere genetiske mutasjoner, modellere miljøeksponeringer eller skjermmedisiner.
I lungen er luftveiene og alveolar epitelceller de første som møter inhalerte miljøeksponeringer, inkludert patogener som overføres via inhalerte aerosoler og skadelige stimuli som sigarettrøyk. Type 2 alveolar epitelceller (AT2s) er avgjørende for å opprettholde lunge homeostase som de er fakultetets forfedre av distal lunge epitel, produsere overflateaktive midler for å lindre alveolar overflatespenning, og montere medfødt immunrespons på inhalert eksponering 1,2. AT2-dysfunksjon kan imidlertid skyldes lungeskader eller mutasjoner i gener som uttrykkes selektivt i AT2-er, for eksempel SFTPC, SFTPB og ABCA3 3,4,5. Tidligere tilnærminger for å studere disse genetiske mutasjonene har stolt på musemodeller6 eller konstruert, mutasjonsholdige vektorer introdusert i udødelige cellelinjer7. Derfor er plattformer som kan modellere effekten av genetiske og miljømessige perturbasjoner på AT2 i de fysiologisk relevante celletypene og i et produktivt in vitro-system, nødvendig for å forstå videre hvilken rolle AT2s spiller i helse og sykdom.
Når det gjelder modellering av luftbårne eksponeringer, har luft-væske grensesnitt (ALI) kulturer av primære luftveis epitelceller blitt brukt til å avsløre viktige molekylære responser på sigarettrøyk8 og for å modellere luftveisinfeksjon 9,10. Et sammenlignbart ALI-kultursystem for alveolar epitelet, et viktig sted for infeksjon eller sykdomsskade, er mye mindre utviklet sammenlignet med luftveis epitelmodellsystemet. Udødeliggjorte cellelinjer har blitt dyrket ved ALI som proxy for alveolar epitel11,12, men disse cellelinjene er transgrafisk forskjellig fra primære alveolar epitelceller13 og mangler viktige cellulære maskiner, for eksempel evnen til å skille ut overflateaktive stoffer eller danne tette veikryss ved ALI12. Primære menneskelige AT2-er kan dyrkes i 3D-sfærer i nærvær av fibroblaster 1,14, men er underlagt begrensninger, inkludert begrenset tilgjengelighet fra eklant lunger og deres tendens til å senesce eller miste cellulær fenotype i de fleste kulturer til dags dato. Disse egenskapene presenterer barrierer for den utbredte adopsjonen av primære AT2 in vitro-studier, selv om det nylig er gjort fremskritt i optimalisering av materfrie 3D-kulturer for utvidelse av primære AT2s 15,16,17,18.
Rettet differensieringsprotokoller er utviklet for å rekapitulere in vivo utviklingsmilepæler for å generere menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSC)-avledet type 2 alveolar epitelceller (iAT2s)19. iAT2s vokser som selvfornyende sfærer i 3D serumfri kultur i et definert medium som inneholder CHIR99021, KGF, deksametason, cAMP og 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), kalt “CK + DCI”19, i fravær av fibroblastmatere og kan dyrkes for >20 passasjer20,21. Videre deler iAT2s et transkripsjonsprogram med humane voksne primære AT2-er, danner lamelllegemer og produserer og pakker overflateaktivtmiddel 19,21,22. Denne protokollen beskriver seriell passivisering av iAT2s ved å dissosiere cellene til en encellet suspensjon. På dette tidspunktet kan iAT2s replatees og utvides ytterligere i 3D-kultur eller belagt i 2D ALI-kultur23. Disse metodene kan brukes til å studere at2s indre biologi i homeostase og sykdom 20,22 og for å forhøre effekten av forbindelser eller stimuli i en skalerbar, fysiologisk relevant plattform 23,24, som tidligere har vist.
AT2s opprettholder lunge homeostase, og dysfunksjon av disse viktige alveolarcellene kan både forårsake og skyldes ulike lungesykdommer. På grunn av vanskeligheten med å få tilgang til og isolere primære menneskelige AT2-er, genereres iAT2s. Ved å anvende de rettede differensieringsmetodene beskrevet andre steder25 og ekspansjons- og cellesåingen som er beskrevet her, kan iPSCer generert fra ethvert individ differensieres til robust selvfornyende iAT2s, og dermed gi pasientspesifikke celler for biomedisinsk forskning, inkludert grunnleggende biomedisinske forskningsutviklingsstudier, sykdomsmodellering, cellebaserte terapier eller narkotikaskjermer. Den nåværende protokollen beskriver en metode for å dissosiere iAT2s til en encellet suspensjon, som deretter kan replates i 3D Matrigel for å generere alveolospheres for celleutvidelse eller replated i 2D ALI kultur for videre eksperimenter.
Protokollen har flere kritiske skritt for å sikre vellykket passivisering og replating i både 3D- og ALI-kulturer. Mekanisk trianturasjon må minimeres, da overdreven pipettering kan redusere cellens levedyktighet. I tillegg er såddtettheten til iAT2s i både 3D- og 2D ALI-kulturer kritisk; for 3D-kultur er generelt 400 celler / μL 3D Matrigel optimal for de fleste iPSC-linjer. Imidlertid har en rekke tettheter fra 100-500 celler / μL til tider vært vellykket, og optimalisering av tettheten kan være nødvendig for forskjellige cellelinjer. For ALI-kulturen er optimalisering av såingstettheten til iAT2s på cellekulturinnleggene også viktig for å oppnå en sammenfallende monolayer av celler 48 timer etter sådd (dvs. på dagen for luftløft). Noen iAT2-linjer krever flere celler per innsetting. Hvis feilsøking er nødvendig, anbefales derfor et område fra 160 000-300 000 celler/innsats for cellekulturinnlegg med 24 brønner. 3D-kulturer kan også skaleres til 24- og 48-brønnsplater ved å opprettholde såddtettheten ved henholdsvis 400 celler/μL 3D-matrise og redusere matrisedråpestørrelsen til henholdsvis 25 μL og 20 μL. ALI-kulturer kan skaleres til 96-brønns cellekulturinnlegg ved å belegge hver innsats med 30 μL av matrisen, plating 80.000 celler i 30 μL per innsats, og fôring med 150 μL basolaterale medier per brønn. Såingstetthet og matrise- og medievolumer må skaleres og optimaliseres tilsvarende for andre plateformater.
En begrensning i denne protokollen er at cellene som brukes til ALI-plating må renses tilstrekkelig til å være NKX2-1+ og SFTPC + 19,20,21,23 for å danne iAT2 ALIer, og ALI-kulturdannelsen kan variere fra linje til linje. I tillegg tillater denne protokollen utvidelse og generering av kun AT2-kulturer, noe som gir et reduksjonistisk modellsystem basert på en enkelt nøkkel alveolarcelletype. Det er viktig at andre relevante alveolarcelletyper, for eksempel alveolar type 1-celler, manglet fra disse plattformene. Andre grupper har hatt suksess med å dyrke primære menneskelige AT2-er som sfæroider eller organotypiske kulturer med eller uten fibroblaster 1,14,15,16,17; Imidlertid har primære menneskelige AT2-er en tendens til å miste sitt uttrykk for viktige overflateaktive stoffer når de dyrkes i normal 2D-kultur uten ALI-forhold26. Videre har nyere arbeid vist at iAT2s uttrykker høyere proliferative markører og lavere AT2 modningsmarkører enn ferske, ukulturerte menneskelige primære AT2s27. Til tross for disse forskjellene mellom iAT2s og ferske primære menneskelige AT2-er, fant vi ut at selv kultiverte primære AT2-er viste transkripsjonsforskjeller fra fersk, ukulturert primær AT2s27, og dermed konkluderer med at disse in vitro-modellene har forskjellige styrker og begrensninger for modellering i vivo lungebiologi.
IAT2-plattformen kan brukes til å studere genetiske mutasjoner fra pasientavledede iPSCer19,20. Systemet kan også skaleres betydelig opp for å imøtekomme høy gjennomstrømning av narkotikascreening. I tillegg er iAT2 ALIer egnet for miljøeksponeringer som viral eller bakteriell infeksjon eller eksponering for sigarettrøyk, e-sigarettdamp eller andre aerosoler23. Oppsummert tillater denne protokollen for å generere både 3D- og 2D ALI-kulturer i iAT2s langsiktig kultur av en sykdomsrelevant celletype og gir en fysiologisk, skalerbar plattform som muliggjør bruk av disse cellene i mange applikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker oppriktig medlemmer av Wilson-, Kotton- og Hawkins-laboratoriene for deres nyttige diskusjoner. Vi er også veldig takknemlige til Greg Miller (CReM Laboratory Manager) og Marianne James (iPSC Core Manager) for deres uvurderlige støtte. Vi takker Brian Tilton og BUMC Flow Cytometry Core for deres tekniske assistanse med cellesortering (støttet av NIH grant #1S10OD021587-01A1). Dette arbeidet ble støttet av et CJ Martin Early Career Fellowship fra Australian National Health and Medical Research Council tildelt RBW; NIH gir F30HL147426 til KMA; en I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award fra The Pulmonary Fibrosis Foundation og en integrert Pilot Grant Award gjennom Boston University Clinical &Translational Science Institute (1UL1TR001430) til KDA; Swiss National Science Foundation (P2ELP3_191217) til ABA; NIH gir U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til DNK; og NIH gir U01TR001810, R01DK101510 og R01DK117940 tildelt AAW; iPSC vedlikehold, banktjenester og deling støttes av NIH grant NO1 75N92020C00005. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av Biorender.com.
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |