Det nuvarande protokollet beskriver humant inducerade pluripotenta stamcellsderiverade typ 2 alveolära epitelliknande celler (iAT2s). Dessa celler kan odlas som självförnyande sfärer i 3D-odling eller anpassas till luft-vätskegränssnitt (ALI) -kultur.
I lungan är det alveolära epitelet en fysisk barriär från miljöstimuli och spelar en viktig roll i homeostas och sjukdom. Typ 2 alveolära epitelceller (AT2s) är de fakultativa förfäderna till det distala lungepitelet. Dysfunktion och skada på AT2 kan bero på och bidra till olika lungsjukdomar. Förbättrad förståelse av AT2-biologi är därför avgörande för att förstå lungbiologi och sjukdom; emellertid, primära mänskliga AT2s är i allmänhet svåra att isolera och begränsad i utbudet. För att övervinna dessa begränsningar kan humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) -härledda typ 2 alveolära epitelceller (iAT2s) genereras genom ett riktat differentieringsprotokoll som rekapitulerar lungutveckling in vivo . iAT2s växer under matarfria förhållanden, delar ett transkriptomiskt program med humana vuxna primära AT2 och utför nyckelfunktioner för AT2s såsom produktion, förpackning och utsöndring av ytaktivt medel. Detta protokoll beskriver metoderna för att upprätthålla självförnyande iAT2s genom seriell passaging i tredimensionell (3D) kultur eller anpassa iAT2s till luft-vätskegränssnitt (ALI) -kultur. En encellssuspension av iAT2s genereras före plätering i 3D-solubiliserad källarmembranmatris (nedan kallad “matris”), där de självmonteras i monolagerade epitelsfärer. iAT2s i 3D-odling kan seriellt dissocieras i encellssuspensioner för att passeras eller pläteras i 2D ALI-kultur. I ALI-kulturen bildar iAT2s ett polariserat monolager med den apikala ytan utsatt för luft, vilket gör denna plattform lätt mottaglig för miljöexponeringar. Därför genererar detta protokoll en outtömlig tillförsel av iAT2s, som producerar upp till 1 x 1030 celler per ingångscell över 15 passager samtidigt som AT2-programmet som indikeras av SFTPCtdTomato-uttryck bibehålls. De resulterande cellerna representerar en reproducerbar och relevant plattform som kan användas för att studera genetiska mutationer, modellera miljöexponeringar eller screena läkemedel.
I lungan är luftvägarna och alveolära epitelceller de första som stöter på inhalerade miljöexponeringar, inklusive patogener som överförs via inhalerade aerosoler och skadliga stimuli som cigarettrök. Typ 2 alveolära epitelceller (AT2) är väsentliga för att upprätthålla lunghomeostas eftersom de är fakultativa föregångare till det distala lungepitelet, producerar ytaktiva ämnen för att lindra alveolära ytspänningar och monterar det medfödda immunsvaret mot inhalerade exponeringar 1,2. AT2-dysfunktion kan dock bero på lungskador eller mutationer i gener som selektivt uttrycks i AT2s, såsom SFTPC, SFTPB och ABCA3 3,4,5. Tidigare metoder för att studera dessa genetiska mutationer har förlitat sig på musmodeller6 eller konstruerade, mutationsinnehållande vektorer som införts i odödliga cellinjer7. Därför behövs plattformar som kan modellera effekterna av genetiska och miljömässiga störningar på AT2 i de fysiologiskt relevanta celltyperna och i ett produktivt in vitro-system för att ytterligare förstå den roll AT2 spelar för hälsa och sjukdom.
När det gäller modellering av luftburna exponeringar har luft-vätskegränssnittskulturer (ALI) av primära luftvägsepitelceller framgångsrikt använts för att avslöja viktiga molekylära svar på cigarettrök8 och för att modellera luftvägsinfektion 9,10. Ett jämförbart ALI-odlingssystem för det alveolära epitelet, en nyckelplats för infektion eller skada vid sjukdom, är mycket mindre utvecklad jämfört med luftvägsepitelmodellsystemet. Odödliga cellinjer har odlats vid ALI som en proxy för det alveolära epitelet11,12, men dessa cellinjer skiljer sig transkriptomiskt från primära alveolära epitelceller13 och saknar viktiga cellulära maskiner, såsom förmågan att utsöndra ytaktiva ämnen eller bilda täta korsningar vid ALI12. Primära mänskliga AT2 kan odlas i 3D-sfärer i närvaro av fibroblaster 1,14 men är föremål för begränsningar, inklusive den begränsade tillgängligheten från explant lungor och deras tendens att senesce eller förlora cellulär fenotyp i de flesta kulturer hittills. Dessa egenskaper utgör hinder för det utbredda antagandet av primära AT2-in vitro-studier, även om de senaste framstegen har gjorts för att optimera matarfria 3D-kulturer för expansion av primära AT2s 15,16,17,18.
Riktade differentieringsprotokoll har utvecklats för att rekapitulera di vivo-utvecklingsmilstolpar för att generera humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) -härledda typ 2 alveolära epitelceller (iAT2s)19. iAT2s växer som självförnyande sfärer i 3D-serumfri kultur i ett definierat medium innehållande CHIR99021, KGF, dexametason, cAMP och 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), kallat “CK + DCI”19, i frånvaro av fibroblastmatare och kan odlas för >20 passager20,21. Dessutom delar iAT2s ett transkriptomiskt program med mänskliga vuxna primära AT2s, bildar lamellära kroppar och producerar och förpackar ytaktivt medel 19,21,22. Detta protokoll beskriver den seriella passaging av iAT2s genom att dissociera cellerna till en encellssuspension. Vid denna tidpunkt kan iAT2s plattas om och utökas ytterligare i 3D-kultur eller pläteras i 2D ALI-kultur23. Dessa metoder kan användas för att studera den inneboende biologin hos AT2 vid homeostas och sjukdom20,22 och för att undersöka effekterna av föreningar eller stimuli i en skalbar, fysiologiskt relevant plattform23,24, vilket tidigare har visats.
AT2s upprätthåller lunghomeostas, och dysfunktion av dessa viktiga alveolära celler kan både orsaka och bero på olika lungsjukdomar. På grund av svårigheten att komma åt och isolera primära mänskliga AT2 genereras iAT2s. Genom att tillämpa de riktade differentieringsmetoder som beskrivs någon annanstans25 och expansionen och cellsådden som beskrivs här kan iPSC: er som genereras från vilken individ som helst differentieras till robust självförnyande iAT2s, vilket ger patientspecifika celler för biomedicinsk forskning, inklusive grundläggande biomedicinska forskningsutvecklingsstudier, sjukdomsmodellering, cellbaserade terapier eller läkemedelsskärmar. Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att dissociera iAT2s till en encellssuspension, som sedan kan ompläteras i 3D Matrigel för att generera alveolosfärer för cellexpansion eller ompläteras i 2D ALI-odling för ytterligare experiment.
Protokollet har flera kritiska steg för att säkerställa framgångsrik passaging och omplating i både 3D- och ALI-kulturer. Mekanisk trituration måste minimeras, eftersom överdriven pipettering kan minska cellviabiliteten. Dessutom är sådddensiteten hos iAT2s i både 3D- och 2D ALI-kulturer kritisk; för 3D-odling är i allmänhet 400 celler/μl 3D Matrigel optimalt för de flesta iPSC-linjer. En rad densiteter från 100-500 celler/μl har dock tidvis varit framgångsrika, och optimering av densiteten kan krävas för olika cellinjer. För ALI-odling är det också viktigt att optimera sådddensiteten hos iAT2s på cellodlingsinsatserna för att uppnå ett sammanflytande monolager av celler 48 timmar efter sådd (dvs. på dagen för luftlyft). Vissa iAT2-linjer kräver fler celler per inlägg; Därför, om felsökning krävs, rekommenderas ett intervall från 160 000-300 000 celler / insats för cellodlingsinsatser med 24 brunnar. 3D-kulturer kan också skalas till 24- och 48-brunnsplattor genom att bibehålla sådddensiteten vid 400 celler / μL 3D-matris och minska matrisdroppsstorleken till 25 μL respektive 20 μL. ALI-kulturer kan skalas till 96-brunns cellodlingsinsatser genom att belägga varje insats med 30 μL av matrisen, plätera 80 000 celler i 30 μL per insats och mata med 150 μL basolaterala medier per brunn. Sådddensitet och matris- och medievolymer måste skalas och optimeras i enlighet därmed för andra plattformat.
En begränsning med detta protokoll är att cellerna som används för ALI-plätering måste renas tillräckligt för att vara NKX2-1+ och SFTPC + 19,20,21,23 för att bilda iAT2 AMI, och ALI-odlingsbildning kan variera från linje till linje. Dessutom tillåter detta protokoll expansion och generering av endast AT2-kulturer, vilket ger ett reduktionistiskt modellsystem baserat på en enda nyckel alveolär celltyp. Viktigt är att andra relevanta alveolära celltyper, såsom alveolära typ 1-celler, saknades från dessa plattformar. Andra grupper har haft framgång med att odla primära mänskliga AT2s som sfäroider eller organotypiska kulturer med eller utan fibroblaster 1,14,15,16,17; emellertid tenderar primära mänskliga AT2: er att förlora sitt uttryck av viktiga ytaktiva ämnen när de odlas i normal 2D-kultur utan ALI-tillstånd26. Dessutom har nyligen utfört arbete visat att iAT2s uttrycker högre proliferativa markörer och lägre AT2-mognadsmarkörer än färska, okulturerade mänskliga primära AT2s27. Trots dessa skillnader mellan iAT2s och färska primära mänskliga AT2s fann vi att även odlade primära AT2s visade transkriptomiska skillnader från färska, okulturerade primära AT2s27, och drar därmed slutsatsen att dessa in vitro-modeller har olika styrkor och begränsningar för modellering in vivo lungbiologi.
iAT2-plattformen kan användas för att studera genetiska mutationer från patient-härledda iPSCs19,20. Systemet skulle också kunna skalas upp avsevärt för att tillgodose läkemedelsscreening med hög kapacitet. Dessutom är iAT2 AMI lämpliga för miljöexponeringar som virus- eller bakterieinfektion eller exponering för cigarettrök, e-cigarettånga eller andra aerosoler23. Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll för att generera både 3D- och 2D ALI-kulturer av iAT2s långsiktig odling av en sjukdomsrelevant celltyp och ger en fysiologisk, skalbar plattform som möjliggör användning av dessa celler i många applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar uppriktigt medlemmar i Wilson- Kotton- och Hawkins-laboratorierna för deras hjälpsamma diskussioner. Vi är också mycket tacksamma mot Greg Miller (CReM Laboratory Manager) och Marianne James (iPSC Core Manager) för deras ovärderliga stöd. Vi tackar Brian Tilton och BUMC Flow Cytometry Core för deras tekniska hjälp med cellsortering (stöds av NIH-bidrag #1S10OD021587-01A1). Detta arbete stöddes av ett CJ Martin Early Career Fellowship från Australian National Health and Medical Research Council som tilldelades RBW; NIH-bidrag F30HL147426 till KMA; ett I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award från The Pulmonary Fibrosis Foundation och ett Integrated Pilot Grant Award genom Boston University Clinical &Translational Science Institute (1UL1TR001430) till KDA; Swiss National Science Foundation (P2ELP3_191217) till ABA; NIH beviljar U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 och R01HL095993 till DNK; och NIH-bidrag U01TR001810, R01DK101510 och R01DK117940 som tilldelats AAW; iPSC-underhåll, bankverksamhet och delning stöds av NIH-bidrag NO1 75N92020C00005. Bild 1 skapades med hjälp av Biorender.com.
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |