ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-ट्राइफॉस्फेट आवश्यक जैविक मार्गों में सर्वव्यापी घटक हैं और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में बढ़ते उपयोग को देखा है। यहां, हम मानक स्वचालित संश्लेषण तकनीकों द्वारा तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-ट्राइफॉस्फेट के नियमित संश्लेषण और शुद्धिकरण के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं।
5′-ट्राइफॉस्फेट एक आवश्यक न्यूक्लिक एसिड संशोधन है जो पूरे जीवन में पाया जाता है और जैव प्रौद्योगिकी और सिंथेटिक जीव विज्ञान में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के कार्यात्मक संशोधन के रूप में तेजी से उपयोग किया जाता है। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-ट्राइफॉस्फेट ऐतिहासिक रूप से एंजाइमी तरीकों से इन विट्रो में तैयार किए गए हैं। हालांकि, ये विधियां प्राकृतिक आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स तक सीमित हैं, मजबूत अनुक्रम प्राथमिकताएं हैं, और विषम उत्पादों का उत्पादन करती हैं। रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के नए तरीके फॉस्फोरामाइड रसायन विज्ञान द्वारा स्वचालित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण की कम लागत और अब उपलब्ध न्यूक्लियोटाइड संशोधनों की विविध श्रृंखला दोनों के पूरक हैं। इस प्रकार, मनमाने ढंग से अनुक्रम और लंबाई के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट का संश्लेषण, और वैकल्पिक रूप से विभिन्न गैर-प्राकृतिक संशोधनों से युक्त, अब सुलभ है।
यह पेपर सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट और पाइरोफॉस्फेट का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए उपयुक्त तरीकों और तकनीकों को प्रस्तुत करता है। यह विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करती है, मानक ठोस-चरण संश्लेषण विधियों द्वारा तैयार किए गए अधिकांश ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ संगत है, और डिप्रोटेक्शन और शुद्धिकरण से पहले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के बाद 2 घंटे में पूरा किया जा सकता है। उत्प्रेरक आरएनए एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट के रूप में रासायनिक रूप से ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के दो उपयोगों का प्रदर्शन किया जाता है, जिसमें गैर-जैविक एल-आरएनए ट्राइफॉस्फेट से हैमरहेड राइबोजाइम के दर्पण-छवि संस्करण का संश्लेषण शामिल है।
आरएनए का 5′-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड रूप जीव विज्ञान में सर्वव्यापी है क्योंकि यह जीवन के सभी डोमेन में आरएनए प्रतिलेखन और कई आरएनए वायरस के जीवन चक्र के दौरान आरएनए प्रतिकृति द्वारा उत्पन्न होता है। ये ट्राइफॉस्फेट यूकेरियोट्स में 7-मिथाइलगुआनिलेट-कैप्ड एमआरएनए के गठन के लिए सब्सट्रेट के रूप में काम करते हैं और इसलिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति1 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। इसके विपरीत, ट्राइफॉस्फेट को बैक्टीरिया और वायरस में बनाए रखा जाता है; इस प्रकार, आरएनए 5′-ट्राइफॉस्फेट को यूकेरियोट्स 2,3,4,5,6,7 में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियामकों द्वारा मान्यता प्राप्त है। जीव विज्ञान के बाहर, आरएनए लिगेज राइबोजाइम का एक मेजबान इन विट्रो8 में 5′-ट्राइफॉस्फेट का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है और नैदानिक परख 9,10,11,12,13,14,15 में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है। इस तरह के एक राइबोजाइम का उपयोग एल-आरएनए के टेम्पलेट-निर्भर संश्लेषण के लिए किया जा सकता है, प्राकृतिक डी-आरएनए के गैर-जैविक “दर्पण-छवि” एनेंटिओमर, छोटे एल-आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-ट्राइफॉस्फेट 16,17,18 से। इन प्रणालियों की जांच के लिए अलग-अलग अनुक्रम और रीढ़ की हड्डी की संरचना के ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की नियमित तैयारी आवश्यक है।
प्रयोगशाला में आरएनए 5′-ट्राइफॉस्फेट तैयार करने के लिए सबसे आम और सुलभ विधि इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा है। हालांकि, इस विधि द्वारा उत्पादित आरएनए आरएनए पोलीमरेज़ एंजाइम के प्रमोटर और सब्सट्रेट आवश्यकताओं द्वारा अनुक्रम और आकार में प्रतिबंधित है। टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ और विशेष डेरिवेटिव इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम पोलीमरेज़ हैं 19,20,21,22। इन एंजाइमों के साथ तैयार इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड आरएनए को 5′-टर्मिनल प्यूरीन के साथ शुरू किया जाना चाहिए और पहले 10 न्यूक्लियोटाइड23,24 में प्यूरीन के प्रति दृढ़ता से पक्षपाती है। इसके अलावा, आधार- या रीढ़ की हड्डी-संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स का एंजाइमेटिक समावेश प्राकृतिक पोलीमरेज़ के साथ सबसे अच्छा अक्षम और अधिक बार असंभव है, जो प्राकृतिक डी-आरएनए के अलावा किसी भी चीज़ से बना ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-ट्राइफॉस्फेट का उत्पादन करने के अवसर को सीमित करता है। एक अन्य सीमित कारक यह है कि इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न आरएनए में पर्याप्त 5 ‘- और 3’ – विषमता हो सकती है और 20 एनटी 23,24,25,26,27 से कम होने पर बेहद विषम उत्पादों के रूप में उत्पादित किया जाता है।
इसके विपरीत, ठोस चरण फॉस्फोरामिडाइट संश्लेषण 28,29,30,31,32,33,34,35 द्वारा तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन का उपयोग किसी भी अनुक्रम के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5‘-ट्राइफॉस्फेट्स 3-50 एनटी लंबे, तैयार करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, फॉस्फोरामिडाइट संश्लेषण के लिए सुलभ न्यूक्लिक एसिड संशोधनों की एक विशाल सरणी को 5‘-ट्राइफॉस्फोराइलेशन 14,15,16,17,18,29,36 से पहले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में जोड़ा जा सकता है। इनमें से कई विधियां फॉस्फिटाइलेशन अभिकर्मक सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट का उपयोग करती हैं, जिसे लुडविग और एकस्टीन द्वारा मोनोन्यूक्लियोसाइड्स37 के समाधान-चरण ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए विकसित किया गया था। इस अभिकर्मक के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का ट्राइफॉस्फोराइलेशन ठोस चरण पर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-हाइड्रॉक्सिल के फॉस्फिटाइलेशन द्वारा प्राप्त किया जाता है, पाइरोफॉस्फेट और ऑक्सीकरण के साथ प्रतिक्रिया द्वारा ट्राइफॉस्फेट में रूपांतरण, ठोस समर्थन, असुरक्षा और शुद्धिकरण (चित्रा 1) 28 से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड की दरार के लिए मानक प्रक्रियाओं के बाद।
चित्रा 1: सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए योजना। पहले चरण में, ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5-हाइड्रॉक्सिल को साल्पसीएल के साथ फॉस्फिटाइलेट किया जाता है। अगले चरण में, चक्रीय मेटाफॉस्फाइट बनाने के लिए 5-सैलिसिल फॉस्फाइट को टीबीएपी के साथ प्रतिक्रिया दी जाती है, फिर तीसरे चरण में डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र ऑक्सीकरण समाधान (0.1 एम आयोडीन / पाइरिडीन / एच2ओ / टीएचएफ) में चक्रीय 5-ट्राइमेटाफॉस्फेट उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीकरण किया जाता है, जो एक ही समाधान28 में रैखिक 5-ट्राइफॉस्फेट उत्पन्न करने के लिए तेजी से हाइड्रोलाइज्ड होता है। 37. अमोनिया में ठोस सीपीजी समर्थन और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के असुरक्षा से बाद में क्षारीय दराररैखिक रूप में किसी भी अवशिष्ट चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फेट को हाइड्रोलाइज करेगी। संक्षिप्त नाम: साल्पक्ल = सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट; टीबीएपी = ट्रिब्यूटिलामोनियम पाइरोफॉस्फेट; टीएचएफ = टेट्राहाइड्रोफ्यूरन; सीपीजी = नियंत्रित ताकना ग्लास; एमईएनएच2 = मिथाइलमाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
यद्यपि इस पद्धति का उपयोग करके प्रारंभिक प्रकाशित रिपोर्ट अक्सर खराब पैदावार और अवांछित साइड उत्पादों 28,37,38 से पीड़ित होती हैं, निर्जल स्थितियों का सावधानीपूर्वक रखरखाव नियमित रूप से उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। यह अभिकर्मकों की सावधानीपूर्वक तैयारी और मानक प्लास्टिक घटकों से इकट्ठे एक साधारण प्रतिक्रिया उपकरण के उपयोग से प्राप्त किया जा सकता है। यहां, हम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए उपयुक्त चरणों का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें अभिकर्मकों की तैयारी, प्रतिक्रिया कक्ष की असेंबली, ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया और ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बाद के डिप्रोटेक्शन और शुद्धिकरण शामिल हैं। प्राकृतिक डी-आरएनए और अजैविक एल-आरएनए रीढ़ की हड्डियों के साथ बड़े न्यूक्लिक एसिड उत्पादों के संश्लेषण के लिए लिगेज राइबोजाइम के लिए सब्सट्रेट के रूप में 5′-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का प्रतिनिधि उपयोग भी शामिल है।
यहां वर्णित ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रक्रिया मानक फॉस्फोरामाइड रसायन विज्ञान का उपयोग करके ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के साथ व्यापक रूप से संगत है। न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट्स में एएमए39 में तेजी से डीप्रोटेक्शन के साथ संगत बेस-लेबिल प्रोटेक्टिंग ग्रुप होने चाहिए, जिसमें फॉस्फाइट पर मानक β-साइनोएथिल, और आइसोब्यूटिल, डाइमिथाइलफॉर्मामिडिल, एसिटाइल, फेनोक्सीएसिटाइल, या न्यूक्लियोबेस के एक्सोसाइक्लिक अमाइन पर 4-आइसोप्रोपाइलफेनोक्सीएसिटाइल समूह शामिल हैं। राइबोज 2′-हाइड्रॉक्सिल समूहों को सिलिल सुरक्षा समूहों द्वारा संरक्षित किया जाना चाहिए, या तो टी-ब्यूटाइलडिमिथाइलसिलिल (टीबीडीएमएस) या त्रि-आइसो-प्रोपिलसिलिलोक्सीमिथाइल (टीओएम) 40,41। बेस-लेबिल पिवालॉयलॉक्सीमिथाइल (पीआईवीओएम) समूह को रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन30 के साथ संगत होने की भी सूचना दी गई है।
सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स 28,29,30,31,32,33,34,35 के रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है। हमने लुडविग-एकस्टीन अभिकर्मक37 का उपयोग करके ट्राइफॉस्फोराइलेशन को सबसे सुलभ में से एक पाया है, जिसमें अभिकर्मकों के कोई विशेष संश्लेषण की आवश्यकता नहीं है और कोई विशेष उपकरण नहीं है। इस विधि द्वारा तैयार ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5′-ट्राइफॉस्फेट का उपयोग नियमित रूप से आरएनए लिगेज राइबोजाइम के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है, जिसमें टेम्पलेट-निर्भर संश्लेषण और इस “दर्पण-छवि” न्यूक्लिक एसिड14,16,17,18 की प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से दुर्गम एल-आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट का उपयोग शामिल है . विधि छोटे 5′-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड स्टेम-लूप आरएनए की तैयारी के लिए भी उपयुक्त है जो कशेरुक 6,7 में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के शक्तिशाली सक्रियकर्ता हैं।
लुडविग-एकस्टीन अभिकर्मक, सैलिसिल फॉस्फोरोक्लोरिडाइट37, पानी के लिए अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड कॉलम पर लोड होने से पहले अभिकर्मक को भंग करते समय पेश किए गए किसी भी पानी को प्रभावी ढंग से साफ करता है। इस बिंदु के बाद, हालांकि, 5′-फॉस्फिटाइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अधिमानतः पाइरोफॉस्फेट पर सिस्टम में पेश किए गए किसी भी पानी के साथ प्रतिक्रिया करेगा, जो वर्कअप28,37,38 के बाद 5′-एच-फॉस्फोनेट साइड उत्पाद का निर्माण करेगा। ट्राइफॉस्फोराइलेशन अभिकर्मकों और ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया कक्ष की सावधानीपूर्वक तैयारी यह सुनिश्चित करती है कि यह पक्ष उत्पाद नहीं बनता है। विलायक सुखाने के लिए, टाइप 4 ए आणविक छलनी को अधिकांश ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण अभिकर्मक कंपनियों द्वारा विभिन्न ब्रांड नामों के तहत अधिकांश कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ संगत टेफ्लॉन बैग में प्रीपैकेज बेचा जाता है। अतिरिक्त सावधानियां, जैसे निर्जल वातावरण के तहत एक दस्ताने बॉक्स में ट्राइफॉस्फोराइलेशन करना, आमतौर पर आवश्यक नहीं है।
टीबीएपी के साथ 5′-फॉस्फिटाइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड की प्रतिक्रिया एक चक्रीय 5′-ट्राइमेटाफॉस्फाइट मध्यवर्ती बनाती है, जिसे तब ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण ऑक्सीडाइज़र समाधान (पानी / यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वाणिज्यिक ऑक्सीडाइज़र समाधान आयोडीन की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करते हैं, और ट्राइफॉस्फेट के पूर्ण ऑक्सीकरण को सुनिश्चित करने के लिए उच्च 0.1 एम आयोडीन एकाग्रता का उपयोग करना आवश्यक है। चक्रीय उत्पाद को एक ही समाधान37 में अंतिम रैखिक 5′-ट्राइफॉस्फेट में हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है, और वैकल्पिक, निर्जल ऑक्सीडाइज़र समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए यदि पानी के अलावा अन्य न्यूक्लियोफाइल के साथ रैखिककरण वांछित है (अनुप्रयोगों के लिए नीचे देखें)33। हालांकि, किसी भी अवशिष्ट चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फेट को ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बाद के क्षारीय डिप्रोटेक्शन के दौरान रैखिक किया जाएगा। चक्रीय 5′-ट्राइमेटाफॉस्फेट का हाइड्रोलिसिस शाखित ट्राइफॉस्फेट37,46 के बजाय केवल रैखिक पैदावार देता है।
ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिप्रोटेक्शन को आमतौर पर 5′-ट्राइफॉस्फोराइलेशन को समायोजित करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन कुछ सावधानियां बरती जानी चाहिए। ट्राइफॉस्फेट क्षारीय स्थितियों के संक्षिप्त संपर्क के लिए अपेक्षाकृत स्थिर है, लेकिन देखभाल की जानी चाहिए कि ट्राइफॉस्फेट को आवश्यकता से अधिक समय तक एएमए में उजागर न करें। 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट से अधिक के लिए अमोनिया या एएमए में अधिक लंबे समय तक उपचार की आवश्यकता वाले समूहों की रक्षा से बचा जाना चाहिए। अधिक कोमल उपचार, जैसे कमरे के तापमान पर अमोनिया में 2 घंटे स्वीकार्य हैं जब अन्य फॉस्फोरामिडाइट सुरक्षा समूहों के साथ संगत होते हैं। सिलिल-संरक्षित सिंथेटिक आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए एक सामान्य, तेज़ डिप्रोटेक्शन विधि ट्राइथाइलमाइन ट्राइहाइड्रोफ्लोराइड और उच्च तापमान47 का उपयोग करती है; हालांकि, आरएनए 5′-ट्राइफॉस्फेट तैयार करते समय इससे बचा जाना चाहिए क्योंकि लंबे समय तक अम्लीय स्थितियां ट्राइफॉस्फेट हाइड्रोलिसिस31,32 में तेजी लाने के लिए पाई जाती हैं।
प्रारंभिक पृष्ठ 5′-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (चित्रा 3 और चित्रा 4) के पोस्टडिप्रोटेक्शन शुद्धिकरण के लिए सबसे सरल और सबसे विश्वसनीय तरीका साबित हुआ है। हालांकि, प्रारंभिक रिवर्स-चरण एचपीएलसी का उपयोग ट्राइफॉस्फोराइलेटेड उत्पादों को शुद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ट्राइफॉस्फोराइलेशन को सत्यापित करते समय 5′-डिफॉस्फेट और, कुछ हद तक, 5′-मोनोफॉस्फेट उत्पादों की उपस्थिति नियमित रूप से देखी जाती है। हमने रासायनिक संश्लेषण या प्रतिलेखन द्वारा तैयार अत्यधिक शुद्ध सामग्री से मास स्पेक्ट्रोमेट्री के दौरान 5′-ट्राइफॉस्फेट विखंडन देखा है, खासकर अगर उपकरण ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के विश्लेषण के लिए अनुकूलित नहीं है। फिर भी, आरपी-एलसी विश्लेषण अक्सर 5′-डिफॉस्फेट साइड उत्पाद का 10% -20% दिखाता है जो लंबे समय तक 5′-ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (चित्रा 4) में मौजूद है। ट्रिब्यूटाइलमोनियम पाइरोफॉस्फेट की वाणिज्यिक तैयारी 20% मोनोफॉस्फेट से दूषित हो सकती है, जो ट्राइफॉस्फोराइलेशन30,31 के दौरान साइड उत्पाद के रूप में 5′-डिफॉस्फेट का उत्पादन करेगी। घर में इस अभिकर्मक की सावधानीपूर्वक तैयारी से बहुत अधिक शुद्ध टीबीएपी स्टॉक31 प्राप्त हो सकते हैं। हालांकि, हमने पाया है कि टीबीएपी के वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग करके ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ट्राइफॉस्फोराइलेटेड अभी भी इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा तैयार सामग्री की तुलना में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं (चित्रा 5 बी) में सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने पर तुलनीय या अधिक प्रतिक्रियाशीलता दिखाते हैं।
लुडविग-एकस्टीन अभिकर्मक के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फोराइलेशन का एक उल्लेखनीय और उपयोग चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फाइट मध्यवर्ती33 का लाभ उठाता है। यदि बाद के ऑक्सीकरण चरण को हेक्सेन में 1 एम टी-ब्यूटाइल पेरोक्साइड के साथ आयोजित किया जाता है, जिसका उपयोग अक्सर निर्जल स्थितियों के तहत ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ऑक्सीकरण के लिए किया जाता है, तो फॉस्फाइट का ऑक्सीकरण रिंग ओपनिंग हाइड्रोलिसिस के बिना होता है, जिससे चक्रीय ट्राइमेटाफॉस्फेट उत्पन्न होता है। इस मध्यवर्ती को तब प्राथमिक अमाइन या अल्कोहल न्यूक्लियोफाइल के साथ प्रतिक्रिया की जा सकती है ताकि γ-फॉस्फेट में संशोधनों के साथ 5′-ट्राइफॉस्फेट प्राप्त किया जा सके। इन संशोधनों में फॉस्फोरामिडेट बॉन्ड द्वारा जुड़े लिपोफिलिक टैग के अलावा शामिल है, जो आरपी-एलसी द्वारा तेजी से ट्राइफॉस्फेट-विशिष्ट शुद्धिकरण की सुविधा प्रदान करता है, इसके बाद ट्राइफॉस्फेट33 से टैग का अम्लीय हाइड्रोलिसिस होता है। γ-फॉस्फेट स्थिति में फ्लोरोसेंट संशोधनों को राइबोजाइम-उत्प्रेरित बंधाव प्रतिक्रियाओं15,33 के लिए वास्तविक समय फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के रूप में उपयोग के लिए भी पेश किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक ग्रेग स्प्रिंगस्टीन, नताशा पॉल, चार्ल्स ओलिया, जूनियर, जोनाथन स्ज़ेपांस्की और कैटरीना झुंग के आभारी हैं, जो रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रियाओं के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं पर उपयोगी चर्चा के लिए और उपयोगी टिप्पणियों के लिए गेराल्ड जॉयस के लिए। इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान एमसीबी 2114588 द्वारा समर्थित किया गया था।
0.22 µm polyethersulfone syringe filter | MilliporeSigma | SLMP025SS | Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5) |
0.22 µm PTFE syringe filter | MilliporeSigma | SLLG013SL | Syringe filter for removing CPG resin (Section 5) |
1 mL plastic syringes | ThermoFisher Scientific | 14-823-434 (BD 309659) | Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
1,4-Dioxane, anhydrous | MilliporeSigma | 296309 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) | MilliporeSigma | 324124 | Triphosphorylation reagent (sections 2–4) |
30 mL glass bottles | MilliporeSigma | 23232 | Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2) |
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene | Bio-Rad Laboratories | 7328103 | Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | For PAGE (sections 5–7) |
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL | Glen Research | 40-4050-50 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
Ammonia-neutralizing Trap | ThermoFisher Scientific | ANT100 and ANS121 | For use with Speedvac DNA130 (section 5) |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad Laboratories | 1610700 | For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7) |
Aqueous ammonia, 28% | MilliporeSigma | 338818 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
Aqueous methylamine, 40% | TCI America | TCI-M0137 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer | PerSeptive Biosystems | Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer | any column-based synthesizer is acceptable (section 1) |
Bead-capture magnet | ThermoFisher Scientific | 12320D | For streptavidin bead capture (section 7) |
Bromophenol blue | Bio-Rad Laboratories | 1610404 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
Deep vacuum oil pump | ThermoFisher Scientific | VLP200-115 | For use with lyophilizer (section 5) |
Drierite dessicant, 10-20 mesh | MilliporeSigma | 737828 | Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2) |
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase | prepared in house18 | 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns | Glen Research | 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
D-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | ANP-3201, 3202, 3203, 3205 | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm | Glen Research | 20-0021-01 | Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1) |
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid | MilliporeSigma | E1894 | Ribozyme reaction buffer component (section 6) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid | MilliporeSigma | EDS | Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7) |
Filters for Expedite synthesis columns | Glen Research | 20-0021-0F | Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1) |
Fluorescent/phosphorescent gel scanner | Cytiva | Amersham Typhoon RGB, 29187193 | For visualizing analytical PAGE (sections 6–7) |
Formamide, deionized | VWR Life Science | 97062 | For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7) |
Gel image quantitation software | Cytiva | ImageQuant TL | For quantifying scanned gel images (section 6) |
Glass desiccator | MilliporeSigma | CLS3121150 | Triphosphorylation solvent storage (section 2) |
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk | ChemGenes | N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
L-RNA hammerhead template | prepared in house18 | 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
L-RNA primer | prepared in house18 | 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
L-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
Lyophilizer/Freeze Dryer | VirTis | Benchtop K | For concentrating oligonucleotides (section 5) |
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid | MilliporeSigma | M2670 | For ribozyme reactions (sections 6–7) |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | MilliporeSigma | 227056 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) | ThermoFisher Scientific | 45000150 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5) |
Non-coring stainless steel needle, 20 G | ThermoFisher Scientific | 14-815-410 | Needles for piercing rubber septa (sections 2–4) |
Oligonucleotide extinction coefficient calculator | Integrated DNA Technologies | OligoAnalyzer Tool | Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5) |
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water | ChemGenes | RN-1456 | Triphosphorylation reagent (section 4) |
PAGE plates | Timberrock/CBS | NGP-250-BO and NO | For PAGE (sections 5–7) |
PAGE power supply | Bio-Rad Laboratories | PowerPac HV 1645056 | For PAGE (sections 5–7) |
PAGE spacers and combs (analytical) | Timberrock/CBS | VGS-0725 and VGC-0714 | For PAGE (sections 6–7) |
PAGE spacers and combs (preparative) | Timberrock/CBS | VGS-3025R and VGC-3001 | For PAGE (section 5) |
PAGE stand | Timberrock/CBS | ASG-250 | For PAGE (sections 5–7) |
Parafilm M | ThermoFisher Scientific | 13-374-12 (Bemis PM999) | Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
PCR thermocycler | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch Thermalcycler | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) | MilliporeSigma | GE17-0010-01 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5) |
Phosphor screens | Cytiva | 28956480 | For visualizing 32P-labeled RNA (section 6) |
Phosphoramidite synthesis reagents | Glen Research | 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 | representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1) |
Polypropylene screw-cap sealable tube | MilliporeSigma | BR780752 | 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5) |
Pyridine, anhydrous | MilliporeSigma | 270970 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) | Novatia | n/a | Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5) |
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white | MilliporeSigma | Z564702 | Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2) |
Self-replicator ribozyme E | prepared in house14 | 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Self-replicator substrate A | prepared in house14 | 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Self-replicator substrate B, transcribed | prepared in house14 | 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves | ChemGenes | DMT-1975 | Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2) |
Sodium Chloride (NaCl), solid | MilliporeSigma | S7653 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
Sodium Hydroxide (NaOH), solid | MilliporeSigma | S8045 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
Statistical data-fitting software | GraphPad | Prism | For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6) |
Streptavidin-coated magnetic beads | ThermoFisher Scientific | 65002 | For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
Sucrose | MilliporeSigma | 84097 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
TBE running buffer, 10x | ThermoFisher Scientific | AAJ62788K3 | For PAGE (sections 5–7) |
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran | Aldrich | 216143 | For removing 2′-silyl protecting groups (section 5) |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad Laboratories | 1610801 | For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7) |
Tributylamine | MilliporeSigma | 90781 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) | MilliporeSigma | P8533 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
Tris base | MilliporeSigma | T6666 | Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7) |
TWEEN20 polysorbate detergent | MilliporeSigma | P7949 | Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7) |
Urea | MilliporeSigma | U5378 | For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7) |
UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000, ND2000 | For measuring oligonucleotide concentrations (section 5) |
Vacuum centrifuge | ThermoFisher Scientific | Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator | For removing AMA and THF (section 5) |
Xylene cyanol | Bio-Rad Laboratories | 1610423 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |