Oligonukleotid 5′-trifosfater er allestedsnærværende komponenter i essensielle biologiske veier og har sett økende bruk i bioteknologiske applikasjoner. Her beskriver vi teknikker for rutinemessig syntese og rensing av oligonukleotid 5′-trifosfater, med utgangspunkt i oligonukleotider fremstilt ved standard automatiserte synteseteknikker.
5′-trifosfatet er en essensiell nukleinsyremodifisering som finnes gjennom hele livet og i økende grad brukes som en funksjonell modifikasjon av oligonukleotider i bioteknologi og syntetisk biologi. Oligonukleotid 5′-trifosfater har historisk blitt fremstilt in vitro ved enzymatiske metoder. Imidlertid er disse metodene begrenset til naturlige RNA oligonukleotider, har sterke sekvenspreferanser, og har en tendens til å produsere heterogene produkter. Nye metoder for kjemisk triphosforylering utfyller både den reduserte kostnaden for automatisert oligonukleotidsyntese ved fosforamidittkjemi og det mangfoldige spekteret av nukleotidmodifikasjoner som nå er tilgjengelige. Således er syntesen av oligonukleotidtrifosfater av vilkårlig sekvens og lengde, og eventuelt inneholder forskjellige ikke-essensielle modifikasjoner, nå tilgjengelig.
Dette papiret presenterer passende metoder og teknikker for kjemisk triposforylering av oligonukleotider ved bruk av salicylfosforokloriditt og pyrofosfat. Denne metoden bruker kommersielt tilgjengelige reagenser, er kompatibel med de fleste oligonukleotider fremstilt ved standard solidfasesyntesemetoder, og kan fullføres i 2 timer etter oligonukleotidsyntese, før debeskyttelse og rensing. To anvendelser av kjemisk triphosforylerte oligonukleotider som substrater for katalytiske RNA-enzymer er demonstrert, inkludert syntese av en speilbildeversjon av hammerhead ribozym fra ikke-biologiske L-RNA-trifosfater.
Den 5′-triphosphorylated form av RNA er allestedsnærværende i biologi som det er generert av RNA transkripsjon i alle domener av livet og ved RNA replikasjon i løpet av livssyklusen til mange RNA virus. Disse trifosfatene tjener som substrat for dannelsen av 7-metylguanylat-kappet mRNA i eukaryoter og spiller derfor en viktig rolle i proteinuttrykk1. I motsetning til dette beholdes trifosfatet i bakterier og virus; dermed gjenkjennes RNA 5′-trifosfater av medfødte immunitetsresponsregulatorer i eukaryoter 2,3,4,5,6,7. Utenfor biologi har en rekke RNA ligase ribozymer blitt utviklet for å bruke 5′-trifosfat in vitro8 og modifisert for bruk i diagnostiske analyser 9,10,11,12,13,14,15. Et slikt ribozym kan brukes til malavhengig syntese av L-RNA, den ikke-biologiske “speilbilde” enantiomeren av naturlig D-RNA, fra små L-RNA oligonukleotid 5′-trifosfater 16,17,18. Rutinemessig forberedelse av triphosforylerte oligonukleotider av varierende sekvens og ryggradssammensetning er avgjørende for å undersøke disse systemene.
Den vanligste og mest tilgjengelige metoden for fremstilling av RNA 5′-trifosfater i laboratoriet er ved in vitro transkripsjon. Imidlertid er RNA produsert ved denne metoden begrenset i rekkefølge og størrelse av promotor- og substratkrav til RNA-polymeraseenzymet. T7 RNA-polymerase og spesialiserte derivater er de vanligste polymerasene som brukes til dette formålet 19,20,21,22. In vitro transkribert RNA fremstilt med disse enzymene må initieres med en 5′-terminal purin og er sterkt forspent mot puriner i de første 10 nukleotidene23,24. Videre er enzymatisk inkorporering av base- eller ryggradsmodifiserte nukleotider i beste fall ineffektiv og oftere umulig med naturlige polymeraser, noe som begrenser muligheten til å produsere oligonukleotid 5′-trifosfater sammensatt av alt annet enn naturlig D-RNA. En annen begrensende faktor er at RNA generert av in vitro transkripsjon kan inneholde betydelig 5 ‘- og 3’- heterogenitet og produseres som ekstremt heterogene produkter når de er kortere enn 20 nt 23,24,25,26,27.
I motsetning til dette kan kjemisk triphosforylering av oligonukleotider fremstilt ved fastfase fosforamidittsyntese 28,29,30,31,32,33,34,35 brukes til å fremstille oligonukleotid 5′-trifosfater 3-50 nt lange, av hvilken som helst sekvens. I tillegg kan et stort utvalg av nukleinsyremodifikasjoner tilgjengelig for fosforamidittsyntese tilsettes oligonukleotider før 5′-triposforylering 14,15,16,17,18,29,36. Mange av disse metodene bruker fosfitetsreagenset salicylfosforokloriditt, som ble utviklet av Ludwig og Eckstein for løsningsfasen trifosforylering av mononukleosider37. Trifosforylering av oligonukleotider med dette reagens oppnås på den faste fase ved fosfatitylasjon av oligonukleotid 5′-hydroksyl, omdannelse til trifosfat ved reaksjon med pyrofosfat og oksidasjon, etterfulgt av standardprosedyrer for spaltning av oligonukleotidet fra fast støtte, debeskyttelse og rensing (figur 1)28.
Figur 1: Skjema for trifosforylering av syntetiske oligonukleotider. I det første trinnet blir oligonukleotid 5ʹ-hydroksyl fosforitetert med SalPCl. I neste trinn reageres 5ʹ-salicylfosfitt med TBAP for å danne den sykliske metafosfitten, deretter i det tredje trinnet oksidert for å generere det sykliske 5ʹ-trimetafosfatet i DNA / RNA synthesizer oksidasjonsløsning (0,1 M jod / pyridin / H2O / THF), som raskt hydrolyseres for å gi det lineære 5ʹ-trifosfatet i samme løsning28,33, 37. Påfølgende alkalisk spaltning fra den faste CPG-støtten og debeskyttelse av oligonukleotidet i vandig MeNH2 / ammoniakk vil hydrolysere ethvert gjenværende syklisk trimetafosfat til lineær form. Forkortelser: SalPCl = salicylfosforokloriditt; TBAP = tributylammoniumpyrofosfat; THF = tetrahydrofuran; CPG = kontrollert pore glass; MeNH2 = metylamin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Selv om tidlige publiserte rapporter som brukte denne metoden ofte led av dårlige utbytter og uønskede sideprodukter 28,37,38, er forsiktig vedlikehold av vannfrie forhold alt som er nødvendig for rutinemessig å oppnå høye utbytter. Dette kan oppnås ved forsiktig fremstilling av reagenser og bruk av en enkel reaksjonsanordning montert fra standard plastkomponenter. Her demonstrerer vi de riktige trinnene for kjemisk triposforylering av oligonukleotider, inkludert fremstilling av reagenser, montering av reaksjonskammeret, triposforyleringsreaksjonen og påfølgende avbeskyttelse og rensing av triposforylerte oligonukleotider. Også inkludert er den representative bruken av 5′-triphosforylerte oligonukleotider som substrater for ligase ribozymer for syntese av større nukleinsyreprodukter med naturlig D-RNA og abiotiske L-RNA-ryggrader.
Triposforyleringsprosedyren beskrevet her er bredt kompatibel med oligonukleotidsyntese ved bruk av standard fosforamidittkjemi. Nukleosidfosforamiditter bør ha baselabile beskyttelsesgrupper som er kompatible med rask deproteksjon i AMA39, inkludert standard β-cyanoetyl på fosfitt og isobutyryl, dimetylformamidyl, acetyl, fenoksyacetyl eller 4-isopropylfenoksyacetylgrupper på nukleosobasenes eksocykliske aminer. Ribose 2′-hydroksylgrupper bør beskyttes av silylbeskyttende grupper, enten t-butyldimetylsilyl (TBDMS) eller tri-iso-propylsilyloksymetyl (TOM)40,41. Den baselabile pivaloyloksymetylgruppen (PivOM) er også rapportert å være kompatibel med kjemisk triposforylering30.
Det er beskrevet flere metoder for kjemisk triposforylering av syntetiske oligonukleotider 28,29,30,31,32,33,34,35. Vi har funnet triphosforylering ved hjelp av Ludwig-Eckstein-reagenset37 for å være en av de mest tilgjengelige, krever ingen spesialisert syntese av reagenser og ikke noe spesialutstyr. Oligonukleotid 5′-trifosfater fremstilt ved denne metoden har blitt brukt rutinemessig som substrater for RNA-ligase ribozymer, inkludert bruk av enzymatisk utilgjengelige L-RNA oligonukleotidtrifosfater for å oppnå malavhengig syntese og replikasjon av denne “speilbilde” nukleinsyre 14,16,17,18 . Metoden er også egnet for fremstilling av små 5′-triphosphorylated stem-loop RNAer som er potente aktivatorer av den medfødte immunresponsen hos vertebrater 6,7.
Ludwig-Eckstein-reagenset, salicylfosforokloliditt37, er svært reaktivt mot vann, og fjerner effektivt alt vann som introduseres når reagenset oppløses før det lastes på oligonukleotidkolonnen. Etter dette punktet vil imidlertid 5′-fosfitetert oligonukleotid fortrinnsvis reagere med noe vann som innføres i systemet over pyrofosfat, og danner et 5′-H-fosfonat sideprodukt etter opparbeidelse 28,37,38. Forsiktig fremstilling av trifosforyleringsreagenser og trifosforyleringsreaksjonskammeret sikrer at dette sideproduktet ikke dannes. For tørking av løsemidler selges molekylsikter av type 4 Å ferdigpakket i teflonposer som er kompatible med de fleste organiske løsningsmidler under forskjellige merkenavn av de fleste oligonukleotidsyntesereagensfirmaer. Ytterligere forholdsregler, som å utføre trifosforylering i et hanskerom under en vannfri atmosfære, er vanligvis ikke nødvendig.
Reaksjon av 5′-fosfitetert oligonukleotid med TBAP danner et syklisk 5′-trimetafosfitt-mellomprodukt, som deretter oksyderes til det sykliske 5′-trimetafosfatet ved bruk av oligonukleotidsynteseoksiderende løsning (jod i vann / pyridin / THF). Det skal bemerkes at kommersielle oksidasjonsløsninger bruker varierende mengder jod, og det er viktig å bruke den høye jodkonsentrasjonen på 0,1 M for å sikre fullstendig oksidasjon til trifosfatet. Det sykliske produktet hydrolyseres til det endelige lineære 5′-trifosfatet i samme løsning37, og alternativt må vannfrie oksidasjonsløsninger brukes hvis linearisering med andre nukleofiler enn vann er ønsket (se nedenfor for anvendelser)33. Eventuelt gjenværende syklisk trimetafosfat vil imidlertid bli linearisert under påfølgende alkalisk deproteksjon av oligonukleotidet. Hydrolyse av syklisk 5′-trimetafosfat gir bare den lineære, snarere enn forgrenet trifosfat37,46.
Oligonukleotid deprotection vanligvis ikke trenger å bli endret for å imøtekomme 5′-triphosphorylation, men noen forholdsregler bør tas. Trifosfatet er relativt stabilt til kortvarig eksponering for alkaliske forhold, men det bør utvises forsiktighet for ikke å eksponere trifosfatet for AMA lenger enn nødvendig. Beskyttelse av grupper som trenger mer langvarig behandling i ammoniakk eller AMA i mer enn 10 minutter ved 65 °C bør unngås. Mer skånsomme behandlinger, som 2 timer i ammoniakk ved romtemperatur, er akseptable når de er kompatible med andre fosforamidittbeskyttende grupper. En vanlig, rask debeskyttelsesmetode for silylbeskyttede syntetiske RNA-oligonukleotider bruker trietylamintrihydrofluorid og høy temperatur47; Dette bør imidlertid unngås ved fremstilling av RNA 5′-trifosfater, da de langvarige sure forholdene er funnet å akselerere trifosfathydrolyse31,32.
Preparativ PAGE har vist seg å være den enkleste og mest pålitelige metoden for postdeprotection rensing av 5′-triphosphorylated oligonukleotider (figur 3 og figur 4). Imidlertid kan forberedende omvendt fase HPLC også brukes til å rense triphosforylerte produkter. Tilstedeværelsen av 5′-difosfat og i mindre grad 5′-monofosfatprodukter observeres rutinemessig ved verifisering av triposforylering ved massespektrometri. Vi har observert 5′-trifosfatfragmentering under massespektrometri fra svært rent materiale fremstilt ved kjemisk syntese eller transkripsjon, spesielt hvis instrumentet ikke er optimalisert for analyse av oligonukleotider. Likevel viser RP-LC-analyse ofte at 10% -20% av 5′-difosfatsideproduktet er tilstede i lengre 5′-triphosforylerte oligonukleotider (figur 4). Kommersielle preparater av tributylammoniumpyrofosfat kan forurenses med så mye som 20% monofosfat, noe som vil gi 5′-difosfat som et sideprodukt under trifosforylering30,31. Forsiktig forberedelse av dette reagenset internt kan gi mye mer rene TBAP-aksjer31. Imidlertid har vi funnet oligonukleotider triphosphorylated ved bruk av kommersielle kilder til TBAP fortsatt viser sammenlignbar eller større reaktivitet når de brukes som substrater i enzymatiske reaksjoner (figur 5B), sammenlignet med materiale fremstilt ved in vitro transkripsjon.
En bemerkelsesverdig videre bruk av oligonukleotidtriosforylering med Ludwig-Eckstein-reagenset utnytter det sykliske trimetafosfitt-mellomproduktet33. Hvis det etterfølgende oksidasjonstrinnet utføres med 1 M t-butylperoksid i heksaner, som ofte brukes til oligonukleotidoksydoksydasjon under vannfrie forhold, oppstår oksidasjon av fosfittet uten ringåpningshydrolyse, noe som gir det sykliske trimetafosfatet. Dette mellomproduktet kan deretter reageres med primære amin- eller alkoholnukleofiler for å gi 5′-trifosfater med modifikasjoner ved γ-fosfat. Disse modifikasjonene inkluderer tilsetning av en lipofil tag forbundet med en fosforamidatbinding, noe som letter rask trifosfatspesifikk rensing ved RP-LC, etterfulgt av sur hydrolyse av taggen fra trifosfat33. Fluorescerende modifikasjoner ved γ-fosfatposisjon kan også introduseres for bruk som sanntids fluorescerende reportere for ribozym-katalyserte ligeringsreaksjoner15,33.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski og Katrina Tjhung for nyttige diskusjoner om beste praksis for kjemiske triposforyleringsreaksjoner og til Gerald Joyce for nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av grant MCB 2114588 fra National Science Foundation.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter | MilliporeSigma | SLMP025SS | Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5) |
0.22 µm PTFE syringe filter | MilliporeSigma | SLLG013SL | Syringe filter for removing CPG resin (Section 5) |
1 mL plastic syringes | ThermoFisher Scientific | 14-823-434 (BD 309659) | Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
1,4-Dioxane, anhydrous | MilliporeSigma | 296309 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) | MilliporeSigma | 324124 | Triphosphorylation reagent (sections 2–4) |
30 mL glass bottles | MilliporeSigma | 23232 | Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2) |
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene | Bio-Rad Laboratories | 7328103 | Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | For PAGE (sections 5–7) |
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL | Glen Research | 40-4050-50 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
Ammonia-neutralizing Trap | ThermoFisher Scientific | ANT100 and ANS121 | For use with Speedvac DNA130 (section 5) |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad Laboratories | 1610700 | For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7) |
Aqueous ammonia, 28% | MilliporeSigma | 338818 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
Aqueous methylamine, 40% | TCI America | TCI-M0137 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer | PerSeptive Biosystems | Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer | any column-based synthesizer is acceptable (section 1) |
Bead-capture magnet | ThermoFisher Scientific | 12320D | For streptavidin bead capture (section 7) |
Bromophenol blue | Bio-Rad Laboratories | 1610404 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
Deep vacuum oil pump | ThermoFisher Scientific | VLP200-115 | For use with lyophilizer (section 5) |
Drierite dessicant, 10-20 mesh | MilliporeSigma | 737828 | Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2) |
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase | prepared in house18 | 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns | Glen Research | 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
D-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | ANP-3201, 3202, 3203, 3205 | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm | Glen Research | 20-0021-01 | Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1) |
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid | MilliporeSigma | E1894 | Ribozyme reaction buffer component (section 6) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid | MilliporeSigma | EDS | Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7) |
Filters for Expedite synthesis columns | Glen Research | 20-0021-0F | Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1) |
Fluorescent/phosphorescent gel scanner | Cytiva | Amersham Typhoon RGB, 29187193 | For visualizing analytical PAGE (sections 6–7) |
Formamide, deionized | VWR Life Science | 97062 | For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7) |
Gel image quantitation software | Cytiva | ImageQuant TL | For quantifying scanned gel images (section 6) |
Glass desiccator | MilliporeSigma | CLS3121150 | Triphosphorylation solvent storage (section 2) |
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk | ChemGenes | N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
L-RNA hammerhead template | prepared in house18 | 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
L-RNA primer | prepared in house18 | 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
L-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
Lyophilizer/Freeze Dryer | VirTis | Benchtop K | For concentrating oligonucleotides (section 5) |
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid | MilliporeSigma | M2670 | For ribozyme reactions (sections 6–7) |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | MilliporeSigma | 227056 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) | ThermoFisher Scientific | 45000150 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5) |
Non-coring stainless steel needle, 20 G | ThermoFisher Scientific | 14-815-410 | Needles for piercing rubber septa (sections 2–4) |
Oligonucleotide extinction coefficient calculator | Integrated DNA Technologies | OligoAnalyzer Tool | Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5) |
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water | ChemGenes | RN-1456 | Triphosphorylation reagent (section 4) |
PAGE plates | Timberrock/CBS | NGP-250-BO and NO | For PAGE (sections 5–7) |
PAGE power supply | Bio-Rad Laboratories | PowerPac HV 1645056 | For PAGE (sections 5–7) |
PAGE spacers and combs (analytical) | Timberrock/CBS | VGS-0725 and VGC-0714 | For PAGE (sections 6–7) |
PAGE spacers and combs (preparative) | Timberrock/CBS | VGS-3025R and VGC-3001 | For PAGE (section 5) |
PAGE stand | Timberrock/CBS | ASG-250 | For PAGE (sections 5–7) |
Parafilm M | ThermoFisher Scientific | 13-374-12 (Bemis PM999) | Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
PCR thermocycler | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch Thermalcycler | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) | MilliporeSigma | GE17-0010-01 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5) |
Phosphor screens | Cytiva | 28956480 | For visualizing 32P-labeled RNA (section 6) |
Phosphoramidite synthesis reagents | Glen Research | 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 | representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1) |
Polypropylene screw-cap sealable tube | MilliporeSigma | BR780752 | 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5) |
Pyridine, anhydrous | MilliporeSigma | 270970 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) | Novatia | n/a | Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5) |
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white | MilliporeSigma | Z564702 | Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2) |
Self-replicator ribozyme E | prepared in house14 | 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Self-replicator substrate A | prepared in house14 | 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Self-replicator substrate B, transcribed | prepared in house14 | 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves | ChemGenes | DMT-1975 | Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2) |
Sodium Chloride (NaCl), solid | MilliporeSigma | S7653 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
Sodium Hydroxide (NaOH), solid | MilliporeSigma | S8045 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
Statistical data-fitting software | GraphPad | Prism | For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6) |
Streptavidin-coated magnetic beads | ThermoFisher Scientific | 65002 | For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
Sucrose | MilliporeSigma | 84097 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
TBE running buffer, 10x | ThermoFisher Scientific | AAJ62788K3 | For PAGE (sections 5–7) |
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran | Aldrich | 216143 | For removing 2′-silyl protecting groups (section 5) |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad Laboratories | 1610801 | For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7) |
Tributylamine | MilliporeSigma | 90781 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) | MilliporeSigma | P8533 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
Tris base | MilliporeSigma | T6666 | Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7) |
TWEEN20 polysorbate detergent | MilliporeSigma | P7949 | Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7) |
Urea | MilliporeSigma | U5378 | For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7) |
UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000, ND2000 | For measuring oligonucleotide concentrations (section 5) |
Vacuum centrifuge | ThermoFisher Scientific | Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator | For removing AMA and THF (section 5) |
Xylene cyanol | Bio-Rad Laboratories | 1610423 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |