Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos
Summary
Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.
Abstract
Nematoides entomopatômicos nos gêneros Heterorhabditis e Steinernema são parasitas obrigatórios de insetos que vivem no solo. A principal característica de seu ciclo de vida é a associação mutualista com as bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente. Os parasitas nematoides são capazes de localizar e entrar em hospedeiros de insetos adequados, subverter a resposta imune do inseto e multiplicar-se eficientemente para produzir a próxima geração que irá ativamente caçar novas presas de insetos para infectar. Devido às propriedades de seu ciclo de vida, nematoides entomopatômicos são agentes de controle biológico popular, que são usados em combinação com inseticidas para controlar pragas destrutivas de insetos agrícolas. Simultaneamente, esses nematoides parasitas representam uma ferramenta de pesquisa para analisar a patogenicidade nematoide e hospedar respostas anti-nematóides. Esta pesquisa é auxiliada pelo desenvolvimento recente de técnicas genéticas e abordagens transcriômicas para entender o papel de moléculas secretas de nematoide durante a infecção. Aqui, um protocolo detalhado sobre a manutenção de nematoides entomopatômicos e o uso de um procedimento de knockdown genético é fornecido. Essas metodologias promovem ainda mais a caracterização funcional dos fatores de infecção por nematoides entomopatômicos.
Introduction
As pesquisas sobre nematoides entomopatômicos (EPN) têm se intensificado nos últimos anos devido principalmente à utilidade desses parasitas em estratégias integradas de manejo de pragas e seu envolvimento em pesquisas biomédicas básicas 1,2. Estudos recentes estabeleceram a EPN como organismos modelo para examinar os componentes genéticos do nematoide que são ativados durante os diferentes estágios do processo de infecção. Essas informações fornecem pistas críticas sobre a natureza e o número de moléculas secretadas pelos parasitas para alterar a fisiologia hospedeira e desestabilizar a resposta imune inata do inseto 3,4. Simultaneamente, esse conhecimento é comumente complementado por novos detalhes sobre o tipo de vias de sinalização imunológica do hospedeiro de insetos e as funções que regulam para restringir a entrada e a disseminação dos patógenos 5,6. Entender esses processos é crucial para vislumbrar ambos os lados da interação dinâmica entre a EPN e seus hospedeiros de insetos. Uma melhor apreciação da relação hospedeiro epn-inseto facilitará, sem dúvida, estudos semelhantes com nematoides parasiticos mamíferos, o que pode levar à identificação e caracterização de fatores infeccionais que interferem no sistema imunológico humano.
Os nematoides da EPN Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. podem infectar uma ampla gama de insetos, e sua biologia tem sido intensamente estudada anteriormente. Os dois parasitas nematoides diferem em seu modo de reprodução, com heterorhabdite sendo auto-fertilizado e Steinernema submetido à reprodução anfímica, embora recentemente S. hermaphroditum tenha sido mostrado para se reproduzir pela auto-fertilização de hermafroditas ou através da partenogênese 7,8,9. Outra diferença entre heterorhabditis e nematoides Steinernema é seu mutualismo simbiótico com dois gêneros distintos de bactérias Gram-negativas, Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente, que são patógenos potentes de insetos. Essas bactérias são encontradas na fase juvenil infecciosa (IJ) da EPN, que detecta hospedeiros suscetíveis, têm acesso ao hemocoel de insetos onde liberam suas bactérias associadas que se replicam rapidamente, e colonizam tecidos de insetos. Tanto a EPN quanto suas bactérias produzem fatores de virulência que desarmam as defesas de insetos e prejudicam a homeostase. Após a morte dos insetos, os IJs nematode desenvolvem-se para se tornarem EPN adultos e completarem seu ciclo de vida. Uma nova coorte de IJs formados em resposta à privação de alimentos e superlotação dentro do cadáver de insetos finalmente emerge no solo para caçar hospedeiros adequados 9,10,11,12.
Aqui, é descrito um protocolo eficiente para manter, amplificar e manipular geneticamente nematoides EPN. Em particular, o protocolo descreve a replicação de IJs simbióticos H. bacteriophora e S. carpocapsae , a geração de IJs de nematoides axenic, a produção de hermafroditas H. bacteriophora para microinjeção, a preparação do dsRNA e a técnica de microinjeção. Esses métodos são essenciais para a compreensão da base molecular da patogenicidade nematode e da imunidade anti-nematode hospedeira.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compreender a base molecular da infecção entomopatômica e imunidade anti-nematode de insetos requer a separação dos parasitas das bactérias mutuamente associadas 13,15,16. Os nematoides entomopatômicos H. bacteriophora e S. carpocapsae vivem junto com as bactérias Gram-negativas P. luminescens e X. nematophila, respectivamente17. Ambas as espécies bacterianas t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington pela leitura crítica do manuscrito. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender. Pesquisa no I.E., J.H., e D. O’H. laboratórios têm sido apoiados pela Universidade George Washington e pela Columbian College of Arts and Sciences facilitando fundos e Fundos de Pesquisa Interdisciplinar.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
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