I nematodi entomopatogeni vivono in simbiosi con i batteri e insieme infettano con successo gli insetti minando il loro sistema immunitario innato. Per promuovere la ricerca sulle basi genetiche dell'infezione da nematodi, vengono descritti metodi per il mantenimento e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni.
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Articolo metodologico
Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni
In questo articolo
Sommario
Abstract
I nematodi entomopatogeni nei generi Heterorhabditis e Steinernema sono parassiti obbligati di insetti che vivono nel terreno. La caratteristica principale del loro ciclo vitale è l'associazione mutualistica con i batteri Photorhabdus e Xenorhabdus, rispettivamente. I parassiti nematodi sono in grado di localizzare ed entrare in ospiti di insetti adatti, sovvertire la risposta immunitaria degli insetti e moltiplicarsi in modo efficiente per produrre la prossima generazione che caccia attivamente nuove prede di insetti da infettare. A causa delle proprietà del loro ciclo vitale, i nematodi entomopatogeni sono popolari agenti di controllo biologico, che vengono utilizzati in combinazione con insetticidi per controllare i parassiti distruttivi degli insetti agricoli. Allo stesso tempo, questi nematodi parassiti rappresentano uno strumento di ricerca per analizzare la patogenicità dei nematodi e le risposte anti-nematodi dell'ospite. Questa ricerca è aiutata dal recente sviluppo di tecniche genetiche e approcci trascrittomici per comprendere il ruolo delle molecole secrete dai nematodi durante l'infezione. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato sul mantenimento dei nematodi entomopatogeni e sull'utilizzo di una procedura di abbattimento genico. Queste metodologie promuovono ulteriormente la caratterizzazione funzionale dei fattori di infezione da nematodi entomopatogeni.
Introduzione
La ricerca sui nematodi entomopatogeni (EPN) si è intensificata negli ultimi anni principalmente a causa dell'utilità di questi parassiti nelle strategie di gestione integrata dei parassiti e del loro coinvolgimento nella ricerca biomedica di base 1,2. Recenti studi hanno stabilito l'EPN come organismi modello in cui esaminare le componenti genetiche dei nematodi che vengono attivate durante le diverse fasi del processo di infezione. Queste informazioni forniscono indizi critici sulla natura e il numero di molecole secrete dai parassiti per alterare la fisiologia dell'ospite e destabilizzare la risposta immuni....
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Protocollo
1. Produzione di giovani infettivi di nematodi simbiotici
- Coprire una capsula di Petri (10 cm) con un pezzo di carta da filtro e aggiungere circa 10-15 larve di Galleria mellonella (Figura 1A).
- Utilizzando una pipetta, erogare 2 mL di acqua contenente circa 25-50 IJ per sospensione da 10 μL sui vermi della cera. Conservare la capsula di Petri in un armadietto a temperatura ambiente.
- A seconda dell'umidità della carta da filtro, aggiungere 1-2 ml di acqua ogni 2 giorni. I vermi di cera infetti da IJ normalmente muoiono entro 48 ore.
- Preparare le trappole d'acqua di White cir....
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Risultati
Per valutare lo stato dei nematodi H. bacteriophora che hanno attraversato l'axenizzazione, è stata determinata la presenza o l'assenza di colonie batteriche di P. luminescens negli IJ. Per fare questo, è stato raccolto un pellet di circa 500 IJ che erano stati precedentemente sterilizzati in superficie e omogeneizzati in PBS. Il trattamento di controllo positivo consisteva in un pellet di circa 500 IJ provenienti dalla coltura di nematodi contenenti batteri simbiotici P. luminescens . I pellet.......
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Discussione
Comprendere le basi molecolari dell'infezione da nematodi entomopatogeni e dell'immunità anti-nematodi degli insetti richiede la separazione dei parassiti dai batteri mutualisticamente associati 13,15,16. I nematodi entomopatogeni H. bacteriophora e S. carpocapsae convivono con i batteri Gram-negativi P. luminescens e X. nematophila, rispettivamente17. Entrambe le speci.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University per la lettura critica del manoscritto. Tutte le figure grafiche sono state realizzate utilizzando BioRender. Ricerca in I. E., J. H. e D. O'H. i laboratori sono stati supportati dalla George Washington University e dal Columbian College of Arts and Sciences facilitando fondi e fondi di ricerca interdisciplinari.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillina | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Pallone per colture cellulari T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Pallone per colture cellulari T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Olio di mais | VWR | 470200-112 | |
| Sciroppo di mais | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Provetta per coltura 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Punte per microloader | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Tubo Falcon 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microiniettore | Eppendorf | 5252000021 | |
| Carta da filtro | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco-Glass | ||
| vetrino coprioggetti | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Anello di inoculazione | VWR | 12000-806 | |
| Kanamicina | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar mugnaio in polvere 500 g |
| LB Brodo | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB brodo mugnaio in polvere 500 g |
| Leica DM IRB Microscopio da ricerca invertito | Microscopio | Central-MacConkey | |
| medio | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Kit di pulizia della trascrizione | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Provetta per microcentrifuga | VWR | 76332-064 | 1,5 ml |
| NanoDrop 2000 Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Siringa ad ago | VWR | BD305155 | 22G |
| Brodo nutriente | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Piastra di Petri partizionata | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Compresse PBS tampone primer PCR a 200 schede di grado biotecnologico |
| Azenta-Pestle | |||
| Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Pestello monouso | |
| Piastra di Petri 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Piastra di Petri 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Lievito estratto | di Millipore-Sigma | Y1625 |
Riferimenti
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Pa....
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Ristampe e permessi
