Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen
Summary
Septine sind Zytoskelettproteine. Sie interagieren mit Lipidmembranen und können Membrankrümmungen im Mikrometerbereich wahrnehmen, aber auch erzeugen. Wir beschreiben in diesem Protokoll Bottom-up-In-vitro-Methoden zur Analyse von Membranverformungen, krümmungsempfindlicher Septinbindung und Septinfilament-Ultrastruktur.
Abstract
Der Membranumbau findet ständig an der Plasmamembran und in zellulären Organellen statt. Um die Rolle der Umwelt (ionische Bedingungen, Protein- und Lipidzusammensetzungen, Membrankrümmung) und die verschiedenen Partner, die mit spezifischen Membranumformungsprozessen verbunden sind, vollständig zu analysieren, verfolgen wir In-vitro-Bottom-up-Ansätze. In den letzten Jahren gab es ein großes Interesse daran, die Rolle von Septinproteinen im Zusammenhang mit schweren Krankheiten aufzudecken. Septine sind essentielle und allgegenwärtige Zytoskelettproteine, die mit der Plasmamembran interagieren. Sie sind unter anderem an der Zellteilung, Zellmotilität, Neuromorphogenese und Spermiogenese beteiligt. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie Septine an Membranen interagieren und sich organisieren, um anschließend Membranverformungen zu induzieren und wie sie empfindlich auf bestimmte Membrankrümmungen reagieren können. Dieser Artikel zielt darauf ab, das Zusammenspiel zwischen der Ultrastruktur von Septinen auf molekularer Ebene und dem Membranumbau im Mikrometerbereich zu entschlüsseln. Zu diesem Zweck wurden knospende Hefe und Säugetierseptinkomplexe rekombinant exprimiert und gereinigt. Eine Kombination von In-vitro-Assays wurde dann verwendet, um die Selbstorganisation von Septinen an der Membran zu analysieren. Unterstützte Lipiddoppelschichten (SLBs), riesige unilamellare Vesikel (GUVs), große unilamellare Vesikel (LUVs) und wellige Substrate wurden verwendet, um das Zusammenspiel zwischen Septin-Selbstorganisation, Membranumformung und Membrankrümmung zu untersuchen.
Introduction
Septine sind filamentbildende Proteine des Zytoskeletts, die mit Lipidmembranen interagieren. Septine sind in Eukaryoten allgegenwärtig und essentiell für zahlreiche zelluläre Funktionen. Sie wurden als die Hauptregulatoren der Zellteilung in knospender Hefe und Säugetieren identifiziert 1,2. Sie sind an Membranumformungsereignissen, Ziliogenese3 und Spermiogenese4 beteiligt. Innerhalb von Säugetierzellen können Septine auch mit Aktin und Mikrotubuli 5,6,7 in einem Bindemittel von Rho GTPasen (BORG)-abhängiger Weise interagieren 8. In verschiedenen Geweben (Neuronen9, Zilien3, Spermatozoen10) wurden Septine als Regulatoren von Diffusionsbarrieren für membrangebundene Komponentenidentifiziert 11. Es wurde auch gezeigt, dass Septine das Membranblasen und die Protrusionsbildung regulieren12. Septine sind als Multitasking-Proteine an der Entstehung verschiedener prävalenter Krankheiten beteiligt13. Ihre Fehlregulation ist mit dem Auftreten von Krebserkrankungen14 und neurodegenerativen Erkrankungen15 verbunden.
Je nach Organismus fügen sich mehrere Septin-Untereinheiten (zwei bei Caenorhabditis elegans bis 13 beim Menschen) zu Komplexen zusammen, deren Organisation gewebeabhängig variiert16. Der grundlegende Septin-Baustein besteht aus zwei bis vier Untereinheiten, die in zwei Kopien vorliegen und in einer stabartigen palindromischen Weise selbst zusammengesetzt sind. In knospender Hefe sind Septine oktamer17,18. In situ werden Septine oft an Stellen mit Mikrometerkrümmung lokalisiert; Man findet sie an Teilungsverengungsstellen, an der Basis von Zilien und Dendriten und am Ringring der Spermatozoen19,20. An der Membran scheint die Rolle der Septine dual zu sein: Sie sind an der Umformung der Lipiddoppelschicht und an der Aufrechterhaltung der Membranintegrität beteiligt21. Daher ist die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von Septinfilament-bildenden Proteinen und/oder Untereinheiten an der Membran entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle. Um spezifische Eigenschaften von Septinen in einer gut kontrollierten Umgebung zu analysieren, sind Bottom-up-In-vitro-Ansätze geeignet. Bisher haben nur wenige Gruppen die biophysikalischen Eigenschaften von Septinen in vitro20,22,23 beschrieben. Im Vergleich zu anderen Filamenten des Zytoskeletts bleibt das derzeitige Wissen über das Verhalten von Septinen in vitro daher begrenzt.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Organisation von Septinfilamenten, die Membranumformung und die Krümmungsempfindlichkeit analysiert werden können19. Zu diesem Zweck wurde eine Kombination aus optischen und elektronenmikroskopischen Methoden (Fluoreszenzmikroskopie, Kryo-Elektronenmikroskopie [Kryo-EM] und Rasterelektronenmikroskopie [REM]) verwendet. Die Membranumformung von mikrometergroßen riesigen unilamellaren Vesikeln (GUVs) wird mittels Fluoreszenz-Lichtmikroskopie sichtbar gemacht. Die Analyse der Anordnung und Ultrastruktur von Septinfilamenten, die an Lipidvesikel gebunden sind, erfolgt mittels Kryo-EM. Die Analyse der Septinkrümmungsempfindlichkeit wird mit REM durchgeführt, indem das Verhalten von Septinfilamenten untersucht wird, die an feststoffgestützte Lipiddoppelschichten gebunden sind, die auf welligen Substraten mit variablen Krümmungen abgeschieden sind, was die Analyse der Krümmungsempfindlichkeit sowohl für positive als auch für negative Krümmungen ermöglicht. Im Vergleich zur vorherigen Analyse20,24 schlagen wir hier vor, eine Kombination von Methoden zu verwenden, um gründlich zu analysieren, wie Septine sich selbst organisieren, synergistisch die Membran verformen und krümmungsempfindlich sein können. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll nützlich und anpassungsfähig an jedes filamentöse Protein ist, das eine Affinität für Membranen aufweist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie oben erwähnt, wurde eine Lipidmischung verwendet, die den Einbau von PI(4,5)P2 in die Lipiddoppelschicht verstärkt und somit Septin-Membran-Wechselwirkungen erleichtert. Tatsächlich haben wir an anderer Stelle25 gezeigt, dass knospende Hefeseptine mit Vesikeln in einer PI(4,5)P2-spezifischen Weise interagieren. Diese Lipidzusammensetzung wurde empirisch aus dem Screening mehrerer Zusammensetzungen angepasst und wird heute von den Autoren häufig verwendet. PI(4,5)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Patricia Bassereau und Daniel Lévy für ihre nützlichen Ratschläge und Gespräche. Diese Arbeit profitierte von der Unterstützung der ANR (Agence Nationale de la Recherche) für die Finanzierung der Projekte “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, und des Projekts “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wird von der Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” und der Fondation pour lea Recherche Médicale finanziert. K. Nakazawa wurde von der Sorbonne Université (AAP Emergence) unterstützt. G.H. Koenderink wurde von der Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) durch die “BaSyC-Building a Synthetic Cell” unterstützt. Gravitationszuschuss (024.003.019). Wir danken der Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) und Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Wir danken dem Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, Mitglied der französischen nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
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