Bottom-Up In Vitro-metoder for å analysere den ultrastrukturelle organisasjonen, membranomformingen og krumningsfølsomhetsoppførselen til septiner
Summary
Septiner er cytoskeletale proteiner. De samhandler med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskalaen. Vi beskriver i denne protokollen bottom-up in vitro metoder for analyse av membrandeformasjoner, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.
Abstract
Membranremodellering skjer konstant ved plasmamembranen og i cellulære organeller. For å fullstendig dissekere miljøets rolle (ioniske forhold, protein- og lipidsammensetninger, membrankrumning) og de forskjellige partnerne knyttet til spesifikke membranomformingsprosesser, foretar vi in vitro bottom-up-tilnærminger. I de senere år har det vært stor interesse for å avsløre rollen som septinproteiner assosiert med store sykdommer. Septiner er essensielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner som interagerer med plasmamembranen. De er involvert i celledeling, cellemotilitet, nevromorfogenese og spermiogenese, blant andre funksjoner. Det er derfor viktig å forstå hvordan septiner interagerer og organiserer seg ved membraner for senere å indusere membrandeformasjoner og hvordan de kan være følsomme for spesifikke membrankrumninger. Denne artikkelen tar sikte på å dechiffrere samspillet mellom ultrastrukturen til septiner på molekylært nivå og membranremodellering som forekommer på mikronskala. Til dette formål ble spirende gjær og pattedyr septinkomplekser rekombinant uttrykt og renset. En kombinasjon av in vitro-analyser ble deretter brukt til å analysere selvmontering av septiner ved membranen. Støttede lipid dobbeltlag (SLBer), gigantiske unilamellære vesikler (GUV), store unilamellære vesikler (LUV) og bølgete substrater ble brukt til å studere samspillet mellom septin selvmontering, membranomforming og membrankrumning.
Introduction
Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner som interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og essensielle for mange cellulære funksjoner. De har blitt identifisert som de viktigste regulatorene for celledeling i spirende gjær og pattedyr 1,2. De er involvert i membranomformingshendelser, ciliogenese3 og spermiogenese4. I pattedyrceller kan septiner også interagere med aktin og mikrotubuli 5,6,7 i et bindemiddel av Rho GTPases (BORG)-avhengig måte 8. I forskjellige vev (nevroner9, cilia3, spermatozoa10) har septiner blitt identifisert som regulatorer av diffusjonsbarrierer for membranbundne komponenter11. Septiner har også vist seg å regulere membran blebbing og fremspring dannelse12. Septiner, som er multi-tasking proteiner, er involvert i fremveksten av ulike utbredte sykdommer13. Deres feilregulering er forbundet med fremveksten av kreft14 og neurodegenerative sykdommer15.
Avhengig av organismen samles flere septin-underenheter (to i Caenorhabditis elegans til 13 hos mennesker) for å danne komplekser hvis organisasjon varierer på en vevavhengig måte16. Den grunnleggende septinbyggeblokken samler to til fire underenheter, til stede i to eksemplarer og selvmontert på en stanglignende palindromisk måte. I spirende gjær er septiner oktamere17,18. In situ er septiner ofte lokalisert på steder med mikrometerkrumning; De finnes på divisjonsinnsnevringssteder, ved foten av cilia og dendritter, og ved ringrommet til spermatozoa19,20. Ved membranen synes rollen som septiner å være dobbel: de er involvert i å omforme lipid dobbeltlaget og i å opprettholde membranintegritet21. Derfor er det avgjørende å undersøke de biofysiske egenskapene til septinfilamentdannende proteiner og / eller underenheter ved membranen for å forstå deres rolle. For å dissekere spesifikke egenskaper til septiner i et godt kontrollert miljø, er bottom-up in vitro tilnærminger hensiktsmessige. Så langt har bare noen få grupper beskrevet de biofysiske egenskapene til septiner in vitro20,22,23. Derfor, sammenlignet med andre cytoskeletale filamenter, er den nåværende kunnskapen om oppførselen til septiner in vitro fortsatt begrenset.
Denne protokollen beskriver hvordan organisering av septinfilamenter, membranomforming og krumningsfølsomhet kan analyseres19. Til dette formål har en kombinasjon av optiske og elektronmikroskopiske metoder (fluorescensmikroskopi, kryo-elektronmikroskopi [cryo-EM] og skanningelektronmikroskopi [SEM]) blitt brukt. Membranomformingen av mikrometerstore gigantiske unilamellære vesikler (GUV) visualiseres ved hjelp av fluorescens optisk mikroskopi. Analysen av arrangementet og ultrastrukturen av septinfilamenter bundet til lipidvesikler utføres ved bruk av kryo-EM. Analyse av septinkrumningsfølsomhet utføres ved bruk av SEM, ved å studere oppførselen til septinfilamenter bundet til solidstøttet lipid dobbeltlag avsatt på bølgete substrater av variable krumninger, noe som muliggjør analyse av krumningsfølsomhet for både positive og negative krumninger. Sammenlignet med tidligere analyse20,24, foreslår vi her å bruke en kombinasjon av metoder for å grundig analysere hvordan septiner kan selvmontere, synergistisk deformere membran og være krumningsfølsom. Denne protokollen antas å være nyttig og tilpasningsdyktig til ethvert filamentøst protein som viser en affinitet for membraner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nevnt ovenfor har en lipidblanding blitt brukt som forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipid-dobbeltlaget og dermed letter septinmembraninteraksjoner. Faktisk har vi vist andre steder25 at spirende gjærseptiner samhandler med vesikler på en PI (4,5) P2-spesifikk måte. Denne lipidsammensetningen ble justert empirisk fra screening av flere komposisjoner og er nå mye brukt av forfatterne. PI (4,5) P2 lipider må håndteres nøye. Stamløsninger må aliquote…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for nyttige råd og diskusjoner. Dette arbeidet dro nytte av støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) for finansiering av prosjektet “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, og prosjektet “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansiert av Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa ble støttet av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink ble støttet av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gjennom ‘BaSyC-Building a Synthetic Cell’. Gravitasjonsstipend (024.003.019). Vi takker Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi takker Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
Riferimenti
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).
