Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos
Summary
Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.
Abstract
A remodelagem da membrana ocorre constantemente na membrana plasmática e dentro de organelas celulares. Para dissecar totalmente o papel do ambiente (condições iônicas, composições proteicas e lipídicas, curvatura de membrana) e os diferentes parceiros associados a processos específicos de remodelação de membrana, realizamos abordagens in vitro de baixo para cima. Nos últimos anos, tem havido grande interesse em revelar o papel das proteínas septinas associadas às principais doenças. As septinas são proteínas citoesqueléticas essenciais e onipresentes que interagem com a membrana plasmática. Eles estão implicados na divisão celular, motilidade celular, neurofogênese e espermaogênese, entre outras funções. É, portanto, importante entender como os septins interagem e se organizam nas membranas para induzir posteriormente deformações de membranas e como elas podem ser sensíveis a curvaturas de membrana específicas. Este artigo tem como objetivo decifrar a interação entre a ultraestruturagem de septinas a nível molecular e a remodelação da membrana que ocorre em escala de mícticos. Para isso, os complexos de leveduras e septinas de mamíferos foram recombinantemente expressos e purificados. Uma combinação de ensaios in vitro foi então usada para analisar a auto-montagem de septinas na membrana. Bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), vesículas unilamellar gigantes (GUVs), vesículas unilamellar grandes (LUVs) e substratos ondulados foram usados para estudar a interação entre automontagem de septina, remodelação da membrana e curvatura da membrana.
Introduction
As septinas são proteínas citoesqueletal que formam filamentos que interagem com membranas lipídicas. Os septinos são onipresentes em eucariotes e essenciais para inúmeras funções celulares. Eles foram identificados como os principais reguladores da divisão celular em leveduras e mamíferos 1,2. Eles estão envolvidos em eventos de remodelação de membrana, ciliogênese3 e espermaiogênese4. Dentro das células mamíferas, os septinos também podem interagir com actina e microtúbulos 5,6,7 em uma pasta de Rho GTPases (BORG) de forma dependente8. Em vários tecidos (neurônios9, cilia3, espermatozoides10), os septinos foram identificados como reguladores de barreiras de difusão para componentes ligados à membrana11. As septinas também foram demonstradas para regular a saliência da membrana e a formação de saliência12. Os septinos, sendo proteínas multitarefas, estão implicados no surgimento de várias doenças prevalentes13. Sua desregulação está associada ao surgimento de cânceres14 e doenças neurodegenerativas15.
Dependendo do organismo, várias subunidades de septina (duas em Caenorhabditis elegans a 13 em humanos) se reúnem para formar complexos cuja organização varia de forma dependente de tecidos16. O bloco básico de construção de septin reúne de duas a quatro subunidades, presentes em duas cópias e auto-montados de forma palindômica semelhante a uma vara. Na levedura brotante, os septins são octamericos 17,18. In situ, os septins são frequentemente localizados em locais com curvatura de micrômetros; eles são encontrados em locais de constrição de divisão, na base de cílios e dendritos, e no anulo de espermatozoides19,20. Na membrana, o papel dos septinos parece ser duplo: eles estão implicados na remodelação do bicamadorão lipídial e na manutenção da integridade da membrana21. Assim, investigar as propriedades biofísicas das proteínas formadoras de filamentos de septina e/ou subunidades na membrana é crucial para entender seu papel. Para dissecar propriedades específicas de septinas em um ambiente bem controlado, abordagens in vitro de baixo para cima são apropriadas. Até agora, apenas alguns grupos descreveram as propriedades biofísicas dos septinos in vitro 20,22,23. Assim, em comparação com outros filamentos citoesqueléticos, o conhecimento atual sobre o comportamento dos septinos in vitro permanece limitado.
Este protocolo descreve como a organização de filamentos de septina, remodelagem de membrana e sensibilidade à curvatura pode ser analisada19. Para isso, foi utilizada uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica (microscopia de fluorescência, microscopia crio-elétron [crio-EM], e microscopia eletrônica de varredura [SEM]). A remodelagem da membrana de vesículas unilamellar gigantes do tamanho de micrômetros (GUVs) é visualizada usando microscopia óptica de fluorescência. A análise do arranjo e ultraestrutura de filamentos de septina ligados a vesículas lipídicas é realizada utilizando-se crio-EM. A análise da sensibilidade à curvatura de septina é realizada utilizando-se o SEM, estudando o comportamento de filamentos de septina vinculados a bicamadas lipídicas de suporte sólido depositadas em substratos ondulados de curvaturas variáveis, o que permite a análise da sensibilidade da curvatura para curvaturas positivas e negativas. Em comparação com a análise anterior20,24, aqui, propomos usar uma combinação de métodos para analisar minuciosamente como os septins podem se auto-montar, sinérgicamente deformar a membrana e ser sensíveis à curvatura. Acredita-se que este protocolo seja útil e adaptável a qualquer proteína filamentosa que mostre afinidade com membranas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como dito acima, tem sido utilizada uma mistura lipídica que melhora a incorporação de PI(4,5)P2 dentro da bicamadas lipídica e facilita assim as interações septina-membrana. De fato, mostramos em outros lugares25 que os septinos de levedura brotante interagem com vesículas de forma específica de PI(4,5)P2. Esta composição lipídica foi ajustada empiricamente a partir da triagem de múltiplas composições e agora é amplamente utilizada pelos autores. Pi(4,5)P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Patricia Bassereau e Daniel Lévy por seus conselhos e discussões úteis. Este trabalho foi beneficiado com o apoio da ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar o projeto “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e o projeto “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-011. B. Chauvin é financiado pela Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” e Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa foi apoiado pela Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink foi apoiado pelo Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) através do ‘BaSyC-Building a Synthetic Cell’. Bolsa de gravitação (024.003.019). Agradecemos à Escala Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) e à Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Agradecemos ao Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, membro da Infraestrutura Nacional de Pesquisa Francesa França-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
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