Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas
Summary
Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.
Abstract
La remodelación de la membrana ocurre constantemente en la membrana plasmática y dentro de los orgánulos celulares. Para diseccionar completamente el papel del medio ambiente (condiciones iónicas, composiciones de proteínas y lípidos, curvatura de membrana) y los diferentes socios asociados con procesos específicos de remodelación de membranas, emprendemos enfoques ascendentes in vitro . En los últimos años, ha habido un gran interés en revelar el papel de las proteínas septina asociadas con las principales enfermedades. Las septinas son proteínas citoesqueléticas esenciales y ubicuas que interactúan con la membrana plasmática. Están implicados en la división celular, la motilidad celular, la neuromorfogénesis y la espermiogénesis, entre otras funciones. Por lo tanto, es importante comprender cómo las septinas interactúan y se organizan en las membranas para inducir posteriormente deformaciones de la membrana y cómo pueden ser sensibles a curvaturas específicas de la membrana. Este artículo tiene como objetivo descifrar la interacción entre la ultraestructura de las septinas a nivel molecular y la remodelación de la membrana que se produce a escala micrométrica. Con este fin, la levadura en ciernes y los complejos de septina de mamíferos se expresaron y purificaron recombinantemente. Luego se utilizó una combinación de ensayos in vitro para analizar el autoensamblaje de septinas en la membrana. Se utilizaron bicapas lipídicas soportadas (SLB), vesículas unilamelares gigantes (GUV), vesículas unilamelares grandes (LUV) y sustratos ondulados para estudiar la interacción entre el autoensamblaje de septinas, la remodelación de la membrana y la curvatura de la membrana.
Introduction
Las septinas son proteínas formadoras de filamentos citoesqueléticos que interactúan con las membranas lipídicas. Las septinas son ubicuas en los eucariotas y esenciales para numerosas funciones celulares. Han sido identificados como los principales reguladores de la división celular en levaduras y mamíferos en ciernes 1,2. Están involucrados en eventos de remodelación de membrana, ciliogénesis3 y espermiogénesis4. Dentro de las células de mamíferos, las septinas también pueden interactuar con actina y microtúbulos 5,6,7 de manera dependiente de Rho GTPasas (BORG) 8. En diversos tejidos (neuronas9, cilios3, espermatozoides10), las septinas han sido identificadas como reguladores de barreras de difusión para componentes unidos a la membrana11. También se ha demostrado que las septinas regulan el blebbing de la membrana y la formación de protrusión12. Las septinas, al ser proteínas multitarea, están implicadas en la aparición de diversas enfermedades prevalentes13. Su mala regulación está asociada con la aparición de cánceres14 y enfermedades neurodegenerativas15.
Dependiendo del organismo, varias subunidades de septina (dos en Caenorhabditis elegans a 13 en humanos) se ensamblan para formar complejos cuya organización varía de manera dependiente del tejido16. El bloque de construcción básico de septina reúne de dos a cuatro subunidades, presentes en dos copias y autoensambladas de una manera palindrómica similar a una varilla. En la levadura en ciernes, las septinas son octaméricas17,18. In situ, las septinas a menudo se localizan en sitios con curvatura micrométrica; Se encuentran en sitios de constricción de división, en la base de cilios y dendritas, y en el anillo de los espermatozoides19,20. En la membrana, el papel de las septinas parece ser dual: están implicadas en la remodelación de la bicapa lipídica y en el mantenimiento de la integridad de la membrana21. Por lo tanto, investigar las propiedades biofísicas de las proteínas formadoras de filamentos de septina y / o subunidades en la membrana es crucial para comprender su papel. Para diseccionar las propiedades específicas de las septinas en un ambiente bien controlado, los enfoques in vitro de abajo hacia arriba son apropiados. Hasta ahora, sólo unos pocos grupos han descrito las propiedades biofísicas de las septinas in vitro20,22,23. Por lo tanto, en comparación con otros filamentos citoesqueléticos, el conocimiento actual sobre el comportamiento de las septinas in vitro sigue siendo limitado.
Este protocolo describe cómo se puede analizar la organización de los filamentos de septina, la remodelación de la membrana y la sensibilidad a la curvatura19. Con este fin, se ha utilizado una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica (microscopía de fluorescencia, microscopía crioelectrónica [cryo-EM] y microscopía electrónica de barrido [SEM]). La remodelación de la membrana de vesículas unilamelares gigantes (GUV) de tamaño micrométrico se visualiza utilizando microscopía óptica de fluorescencia. El análisis de la disposición y ultraestructura de los filamentos de septina unidos a vesículas lipídicas se realiza mediante crio-EM. El análisis de la sensibilidad a la curvatura de septina se lleva a cabo mediante SEM, mediante el estudio del comportamiento de los filamentos de septina unidos a bicapas lipídicas sólidas depositadas sobre sustratos ondulados de curvaturas variables, lo que permite el análisis de la sensibilidad a la curvatura tanto para curvaturas positivas como negativas. En comparación con el análisis anterior20,24, aquí proponemos utilizar una combinación de métodos para analizar a fondo cómo las septinas pueden autoensamblarse, deformar sinérgicamente la membrana y ser sensibles a la curvatura. Se cree que este protocolo es útil y adaptable a cualquier proteína filamentosa que muestre una afinidad por las membranas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se indicó anteriormente, se ha utilizado una mezcla lipídica que mejora la incorporación de PI(4,5)P2 dentro de la bicapa lipídica y, por lo tanto, facilita las interacciones septina-membrana. De hecho, hemos demostrado en otra parte25 que las septinas de levadura en ciernes interactúan con las vesículas de una manera específica de PI(4,5)P2. Esta composición lipídica se ajustó empíricamente a partir del cribado de múltiples composiciones y ahora es ampliamen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Patricia Bassereau y Daniel Lévy por sus útiles consejos y discusiones. Este trabajo contó con el apoyo de la ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar el proyecto “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, y el proyecto “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin está financiado por la Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” y la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa fue apoyado por la Universidad de la Sorbona (AAP Emergence). G.H. Koenderink recibió el apoyo de la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) a través del ‘BaSyC-Building a Synthetic Cell’. Beca de gravitación (024.003.019). Agradecemos a Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) y Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Agradecemos al Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, miembro de la Infraestructura Nacional de Investigación de Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
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