JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Septinlerin Ultrayapısal Organizasyonunu, Membran Yeniden Şekillendirmesini ve Eğrilik Duyarlılığı Davranışını Analiz Etmek için Aşağıdan Yukarıya In Vitro Yöntemler

Published: August 17, 2022
doi:
10.3791/63889
, , , , , , , , , , ,
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University,Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249,Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering,Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS),Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC),Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology,Czech Academy of Sciences, BIOCEV

Summary

Septinler sitoiskelet proteinleridir. Lipid membranlarla etkileşime girerler ve mikron ölçeğinde membran eğriliğini algılayabilir ancak aynı zamanda üretebilirler. Bu protokolde membran deformasyonlarını, eğriliğe duyarlı septin bağlanmasını ve septin filament ultrayapısını analiz etmek için aşağıdan yukarıya in vitro metodolojileri tanımladık.

Abstract

Membran yeniden şekillenmesi plazma zarında ve hücresel organellerde sürekli olarak gerçekleşir. Çevrenin rolünü (iyonik koşullar, protein ve lipit bileşimleri, membran eğriliği) ve spesifik membran yeniden şekillendirme süreçleriyle ilişkili farklı ortakları tam olarak incelemek için, in vitro aşağıdan yukarıya yaklaşımlar benimsiyoruz. Son yıllarda, septin proteinlerinin büyük hastalıklarla ilişkili rolünü ortaya çıkarmaya büyük ilgi duyulmaktadır. Septinler, plazma zarı ile etkileşime giren esansiyel ve her yerde bulunan sitoiskelet proteinleridir. Diğer fonksiyonların yanı sıra hücre bölünmesi, hücre hareketliliği, nöro-morfogenez ve spermiogenezde rol oynarlar. Bu nedenle, septinlerin membranlarda nasıl etkileşime girdiğini ve daha sonra membran deformasyonlarını indüklemek için nasıl organize olduklarını ve spesifik membran eğriliklerine nasıl duyarlı olabileceklerini anlamak önemlidir. Bu makale, septinlerin moleküler düzeyde ultra yapısı ile mikron ölçeğinde meydana gelen membran yeniden şekillenmesi arasındaki etkileşimi deşifre etmeyi amaçlamaktadır. Bu amaçla, tomurcuklanan maya ve memeli septin kompleksleri rekombinant olarak eksprese edildi ve saflaştırıldı. Daha sonra membrandaki septinlerin kendi kendine montajını analiz etmek için in vitro testlerin bir kombinasyonu kullanıldı. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB’ler), dev unilamellar veziküller (GUV’lar), büyük unilamellar veziküller (LUV’ler) ve dalgalı substratlar, septinin kendi kendine montajı, membran yeniden şekillendirme ve membran eğriliği arasındaki etkileşimi incelemek için kullanıldı.

Introduction

Septinler, lipid membranları ile etkileşime giren sitoiskelet filament oluşturan proteinlerdir. Septinler ökaryotlarda her yerde bulunur ve çok sayıda hücresel fonksiyon için gereklidir. Tomurcuklanan maya ve memelilerde hücre bölünmesinin ana düzenleyicileri olarak tanımlanmışlardır 1,2. Membran yeniden şekillendirme olaylarında, siliyogenez3’te ve spermiyogenez4’te rol oynarlar. Memeli hücrelerinde, septinler ayrıca Rho GTPazların (BORG) bağımlı bir şekilde 8 bağlayıcısında aktin ve mikrotübüller5,6,7 ile etkileşime girebilir. Çeşitli dokularda (nöronlar9, kirpikler3, spermatozoa10), septinler membrana bağlı bileşenler için difüzyon bariyerlerinin düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır11. Septinlerin ayrıca membran ağartmasını ve çıkıntı oluşumunu düzenlediği gösterilmiştir12. Çok görevli proteinler olan septinler, çeşitli yaygın hastalıkların ortaya çıkmasında rol oynar13. Yanlış düzenlemeleri, kanserlerinortaya çıkması ile ilişkilidir 14 ve nörodejeneratif hastalıklar15.

Organizmaya bağlı olarak, birkaç septin alt birimi (Caenorhabditis elegans’ta iki, insanlarda 13’e kadar), organizasyonu dokuya bağımlı bir şekilde değişen kompleksler oluşturmak için bir araya gelir16. Temel septin yapı bloğu, iki kopya halinde bulunan ve çubuk benzeri palindromik bir şekilde kendiliğinden monte edilen iki ila dört alt birim toplar. Tomurcuklanan mayada, septinler oktamerik 17,18’dir. In situ, septinler genellikle mikrometre eğriliği olan bölgelerde lokalizedir; bölünme daralma bölgelerinde, kirpik ve dendritlerin tabanında ve spermatozoa anulusundabulunurlar 19,20. Membranda, septinlerin rolü ikili görünmektedir: lipid çift katmanının yeniden şekillendirilmesinde ve membran bütünlüğünün korunmasında rol oynarlar21. Bu nedenle, septin filament oluşturan proteinlerin ve / veya membrandaki alt birimlerin biyofiziksel özelliklerinin araştırılması, rollerini anlamak için çok önemlidir. İyi kontrol edilen bir ortamda septinlerin spesifik özelliklerini incelemek için, aşağıdan yukarıya in vitro yaklaşımlar uygundur. Şimdiye kadar, sadece birkaç grup septinlerin in vitro20,22,23 biyofiziksel özelliklerini tanımlamıştır. Bu nedenle, diğer sitoiskelet filamentleri ile karşılaştırıldığında, septinlerin in vitro davranışı hakkındaki mevcut bilgiler sınırlı kalmaktadır.

Bu protokol, septin filamentlerinin organizasyonunun, membran yeniden şekillendirmenin ve eğrilik duyarlılığının nasıl analiz edilebileceğini açıklar19. Bu amaçla, optik ve elektron mikroskobu yöntemlerinin bir kombinasyonu (floresan mikroskobu, kriyo-elektron mikroskobu [kriyo-EM] ve taramalı elektron mikroskobu [SEM]) kullanılmıştır. Mikrometre boyutundaki dev unilamellar veziküllerin (GUV’ler) membran yeniden şekillendirilmesi, floresan optik mikroskopi kullanılarak görselleştirilir. Lipid veziküllerine bağlı septin filamentlerinin düzenlenmesi ve ultrayapısının analizi kriyo-EM kullanılarak gerçekleştirilir. Septin eğrilik duyarlılığının analizi, hem pozitif hem de negatif eğrilikler için eğrilik duyarlılığının analizini sağlayan, değişken eğriliklerin dalgalı substratları üzerinde biriken katı destekli lipit çift katmanlarına bağlı septin filamentlerinin davranışını inceleyerek SEM kullanılarak gerçekleştirilir. Önceki analiz20,24 ile karşılaştırıldığında, burada, septinlerin kendi kendine nasıl birleşebileceğini, membranı sinerjik olarak deforme edebileceğini ve eğriliğe duyarlı olabileceğini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için bir yöntem kombinasyonu kullanmayı öneriyoruz. Bu protokolün, membranlar için bir afinite gösteren herhangi bir filamentli proteine yararlı ve uyarlanabilir olduğuna inanılmaktadır.

Protocol

1. Dev unilamellar veziküller (GUV’ler) kullanılarak membran yeniden şekillendirmenin belirlenmesi NOT: Bu bölümde, hücresel bağlamda septinler tarafından indüklenmesi muhtemel membran deformasyonlarını taklit etmek için GUV’lar üretilmektedir. Gerçekten de, hücrelerde, septinler sıklıkla mikrometre eğrilikleri olan bölgelerde bulunur. GUV’lar birkaç ila onlarca mikrometre arasında değişen boyutlara sahiptir ve deforme olabilir. Bu nedenle, mikrometre öl?…

Representative Results

GUV’ların deformasyonlarıSeptinlerle inkübe edildikten sonra yeniden şekillenen GUV’ların tipik konfokal floresan görüntüleri, septinlerin polimerize olduğu koşullarda Şekil 3’te gösterilmiştir. Çıplak GUV’lar (Şekil 3A) mükemmel bir şekilde küreseldi. 50 nM’den fazla tomurcuklanan maya septin filamentleri ile inkübasyon üzerine, veziküller deforme olmuş olarak ortaya çıktı. 100 nM tomurcuklanan maya septin oktamer …

Discussion

Yukarıda belirtildiği gibi, lipid çift katmanı içinde PI (4,5) P2 ilişkisini artıran ve böylece septin-membran etkileşimlerini kolaylaştıran bir lipit karışımı kullanılmıştır. Gerçekten de,25 başka bir yerde, tomurcuklanan maya septinlerinin veziküllerle PI (4,5) P2’ye özgü bir şekilde etkileşime girdiğini gösterdik. Bu lipit bileşimi, çoklu kompozisyonların taranmasından ampirik olarak ayarlanmıştır ve şimdi yazarlar tarafından yaygın ol…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Patricia Bassereau ve Daniel Lévy’ye yararlı tavsiyeleri ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 projesini ve “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01 projesini finanse etmek için ANR’nin (Agence Nationale de la Recherche) desteğinden yararlandı. B. Chauvin Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” ve Fondation pour lea Recherche Médicele tarafından finanse edilmektedir. K. Nakazawa, Sorbonne Université (AAP Emergence) tarafından desteklendi. G.H. Koenderink, Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) tarafından ‘BaSyC-Building a Synthetic Cell’ aracılığıyla desteklendi. Yerçekimi hibesi (024.003.019). Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) ve Paris Sciences et Lettres’e (ANR-10-IDEX-0001-02) teşekkür ederiz. Hücre ve Doku Görüntüleme (PICT-IBiSA), Fransız Ulusal Araştırma Altyapısı Fransa-BioImaging (ANR10-INBS-04) üyesi Institut Curie’ye teşekkür ederiz.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).

Tags

Keywords: In Vitro MethodsUltrastructural OrganizationMembrane ReshapingCurvature SensitivitySeptinsCytoskeletal FilamentsNorland Optical AdhesivePolydimethylsiloxaneSupported Lipid BilayerScanning Electron Microscopy
check_url/it/63889?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image