Bottom-Up In Vitro-metoder för att analysera ultrastrukturell organisation, membranomformning och krökningskänslighetsbeteende hos septiner
Summary
Septiner är cytoskelettproteiner. De interagerar med lipidmembran och kan känna av men också generera membrankrökning på mikronskalan. Vi beskriver i detta protokoll bottom-up in vitro-metoder för att analysera membrandeformationer, krökningskänslig septinbindning och septinfilamentultrastruktur.
Abstract
Membranombyggnad sker ständigt vid plasmamembranet och inom cellulära organeller. För att helt dissekera miljöns roll (joniska förhållanden, protein- och lipidkompositioner, membrankrökning) och de olika partnerna som är associerade med specifika membranomformningsprocesser, genomför vi di vitro-bottom-up-metoder. Under de senaste åren har det funnits ett stort intresse för att avslöja rollen av septinproteiner associerade med stora sjukdomar. Septiner är väsentliga och allestädes närvarande cytoskelettproteiner som interagerar med plasmamembranet. De är inblandade i celldelning, cellmotilitet, neuromorfogenes och spermiogenes, bland andra funktioner. Det är därför viktigt att förstå hur septiner interagerar och organiserar vid membran för att därefter inducera membrandeformationer och hur de kan vara känsliga för specifika membrankrökningar. Denna artikel syftar till att dechiffrera samspelet mellan ultrastrukturen hos septiner på molekylär nivå och membranombyggnaden som sker i mikronskala. För detta ändamål uttrycktes och renades spirande jäst- och däggdjursseptinkomplex rekombinant. En kombination av in vitro-analyser användes sedan för att analysera självmontering av septiner vid membranet. Stödda lipid-dubbelskikt (SLB), gigantiska unilamellära vesiklar (GUVs), stora unilamellära vesiklar (LUVs) och vågiga substrat användes för att studera samspelet mellan septin-självmontering, membranomformning och membrankrökning.
Introduction
Septiner är cytoskelettfilamentbildande proteiner som interagerar med lipidmembran. Septiner är allestädes närvarande i eukaryoter och väsentliga för många cellulära funktioner. De har identifierats som de viktigaste regulatorerna för celldelning i spirande jäst och däggdjur 1,2. De är involverade i membranomformningshändelser, ciliogenes3 och spermiogenes4. Inom däggdjursceller kan septiner också interagera med aktin och mikrotubuli 5,6,7 i ett bindemedel av Rho GTPaser (BORG)-beroende sätt 8. I olika vävnader (neuroner9, cilia3, spermatozoa10) har septiner identifierats som regulatorer för diffusionsbarriärer för membranbundna komponenter11. Septiner har också visat sig reglera membran blebbing och utsprångsbildning12. Septiner, som är multi-tasking-proteiner, är inblandade i uppkomsten av olika vanliga sjukdomar13. Deras felreglering är förknippad med uppkomsten av cancer14 och neurodegenerativa sjukdomar15.
Beroende på organismen samlas flera septinunderenheter (två i Caenorhabditis elegans till 13 hos människor) för att bilda komplex vars organisation varierar på ett vävnadsberoende sätt16. Den grundläggande septinbyggstenen samlar två till fyra underenheter, närvarande i två kopior och självmonterade på ett stavliknande palindroma sätt. I spirande jäst är septiner oktameriska17,18. På plats är septiner ofta lokaliserade på platser med mikrometerkrökning; De finns vid divisionsförträngningsställen, vid basen av flimmerhår och dendriter och vid spermatozoas annulus19,20. Vid membranet verkar septinernas roll vara dubbel: de är inblandade i att omforma lipid-dubbelskiktet och upprätthålla membranintegriteten21. Därför är det avgörande att undersöka de biofysiska egenskaperna hos septinfilamentbildande proteiner och / eller underenheter vid membranet för att förstå deras roll. För att dissekera specifika egenskaper hos septiner i en välkontrollerad miljö är bottom-up in vitro-metoder lämpliga. Hittills har endast ett fåtal grupper beskrivit de biofysiska egenskaperna hos septiner in vitro20,22,23. Därför, jämfört med andra cytoskeletala filament, är den nuvarande kunskapen om beteendet hos septiner in vitro fortfarande begränsad.
Detta protokoll beskriver hur organisationen av septinfilament, membranomformning och krökningskänslighet kan analyseras19. För detta ändamål har en kombination av optiska och elektronmikroskopimetoder (fluorescensmikroskopi, kryoelektronmikroskopi [kryo-EM] och svepelektronmikroskopi [SEM]) använts. Membranomformningen av mikrometerstora jätteunilamellära vesiklar (GUVs) visualiseras med hjälp av fluorescensoptisk mikroskopi. Analysen av arrangemanget och ultrastrukturen hos septinfilament bundna till lipidblåsor utförs med användning av kryo-EM. Analys av septinkrökningskänslighet utförs med hjälp av SEM genom att studera beteendet hos septinfilament bundna till faststödda lipid-dubbelskikt avsatta på vågiga substrat med variabla krökningar, vilket möjliggör analys av krökningskänslighet för både positiva och negativa krökningar. Jämfört med tidigare analys20,24 föreslår vi här att använda en kombination av metoder för att noggrant analysera hur septiner kan självmontera, synergistiskt deformera membran och vara krökningskänsliga. Detta protokoll tros vara användbart och anpassningsbart till alla trådformiga proteiner som visar en affinitet för membran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nämnts ovan har en lipidblandning använts som förbättrar PI (4,5) P2-införlivandet i lipid-dubbelskiktet och därmed underlättar septin-membraninteraktioner. Faktum är att vi har visat någon annanstans25 att spirande jästseptiner interagerar med vesiklar på ett PI (4,5) P2-specifikt sätt. Denna lipidkomposition justerades empiriskt från screening av flera kompositioner och används nu i stor utsträckning av författarna. PI(4,5)P2-lipider måste ha…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Patricia Bassereau och Daniel Lévy för deras goda råd och diskussioner. Detta arbete fick stöd från ANR (Agence Nationale de la Recherche) för att finansiera projektet “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 och projektet “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin finansieras av Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” och Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa stöddes av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink stöddes av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) genom “BaSyC-Building a Synthetic Cell”. Gravitation bidrag (024.003.019). Vi tackar Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) och Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi tackar Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem av den franska nationella forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
Riferimenti
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).
