דלקת במשטח העין פוגעת ברקמות פני השטח של העין ופוגעת בתפקודים חיוניים של העין. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת דלקת עיניים ולאיסוף רקמות פגועות במודל עכברי של תפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD).
מחלות פני השטח של העין כוללות מגוון של הפרעות המפריעות לתפקודים ולמבנים של הקרנית, הלחמית ורשת בלוטת פני השטח של העין הקשורה. בלוטות Meibomian (MG) מפרישות שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק המימי של סרט הדמעות. נויטרופילים ומלכודות דנ”א חוץ-תאיות מאכלסים את MG ואת משטח העין במודל עכברי של מחלת עיניים אלרגית. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי החופה את שקעי MG וממתנת תפקוד לקוי של MG. כאן, שיטה לגרימת דלקת פני השטח של העין ותפקוד לקוי של MG מוצגת. ההליכים לאיסוף איברים הקשורים למשטח העין, כגון הקרנית, הלחמית והעפעפיים, מתוארים בפירוט. באמצעות טכניקות מבוססות לעיבוד כל איבר, מוצגות גם התכונות המורפולוגיות וההיסטופתולוגיות העיקריות של תפקוד לקוי של MG. הפרשות עיניים מציעות את ההזדמנות להעריך את המצב הדלקתי של משטח העין. נהלים אלה מאפשרים לחקור התערבויות אנטי דלקתיות אקטואליות ומערכתיות ברמה הפרה-קלינית.
כל הרף עין מחדש את שכבת הדמעות החלקה המפוזרת על הקרנית. אפיתליה של פני השטח של העין מקלה על ההתפלגות והכיוון הנכון של סרט הדמעות על משטח העין. מוצינים מסופקים על ידי תאי אפיתל הקרנית והלחמית כדי לסייע במיקום החלק המימי של סרט הדמעות המגיע מבלוטות הדמעות על פני העיניים. לבסוף, MG מפרישה שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק מימי של סרט הדמעות 1,2,3. באופן זה, הפונקציות המתואמות של כל איברי העין מגינות על משטח העין מפני פלישה לפתוגנים או פציעה ותומכות בראייה צלולה ללא כל כאב או אי נוחות.
במשטח עיניים בריא, הפרשות העיניים הזורמות או ריאה העין מסלקות אבק, תאי אפיתל מתים, חיידקים, ריר ותאי מערכת החיסון. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי ומשלבות רכיבים אלה בראום העין. AggNETs פותרים דלקת על ידי פירוק פרוטאוליטי של ציטוקינים מעודדי דלקת וכימוקינים4. עם זאת, כאשר הם הופכים לא מתפקדים, aggNETs אלה aggNETs מניעים את הפתוגנזה של מחלות כגון חסימות כלי דם ב- COVID-195, אבני מרה6, ו sialolithiasis7. באופן דומה, aggNETs על משטח העין ממלאים תפקיד מגן ותורמים לפתרון דלקת של משטח8 החשוף מאוד. היווצרות מוגזמת או היעדר aggNETs במשטח העין עלולים לפגוע ביציבות סרט הדמעות ו/או לגרום לפצעים בקרנית, דלקת הלחמית ומחלת העין היבשה. לדוגמה, חסימת MG היא גורם מוביל למחלת העין היבשה9. AggNETs ידועים גם לחבר את זרימת הפרשת השומנים מן הצינורות של MG ולגרום לתפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD). הגודש של MG orifices על ידי aggNETs גורם למחסור בנוזל שומני העוטף את משטח העין ונוזל מבוקבק מדרדר, וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של בלוטת הבלוטה ונזק אקסינארי. תפקוד לקוי זה עלול לגרום לאידוי סרט מדמיע, פיברוזיס של שולי העפעפיים, דלקת עיניים ונזק מזיק ל- MG10,11.
מספר מודלים של בעלי חיים פותחו במהלך השנים כדי לחקות את התהליך הפתולוגי של MGD בבני אדם. לדוגמה, C57BL/6 עכברים בני שנה סייעו לחקור השפעות הקשורות לגיל על מחלות עיניים יבשות (DED) ו- MGD, המשקפות את הפתולוגיה של מחלות עיניים בחולים בני 50 ומעלה12,13,14. יתר על כן, ארנבות הן מודלים מתאימים לחקר ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות. לכן, גרימת MGD בארנבות דווחה על ידי מתן מקומי של אפינפרין או הכנסה מערכתית של 13-cis-retinoic חומצה (isotretinoin)15,16,17,18,19.
אף על פי שמודלים אלה של בעלי חיים היו מספיקים לקביעת הגורמים השונים שתרמו לפתופיזיולוגיה של MGD, הם היו מוגבלים בשימוש בהם. לדוגמה, מודל מורין של MGD תלוי גיל היה אידיאלי לפענוח אלמנטים במבוגרים בלבד, ולכן, ארנבות נראו כמודל החי המתאים ביותר לחקר מחלות פני השטח של העין, מכיוון שהן מאפשרות לחקור מנגנונים פתופיזיולוגיים מרובים. עם זאת, בשל היעדר כלים אנליטיים מקיפים לאיתור חלבונים על פני העין ומכיוון שחלקים רבים בגנום הארנב אינם מוזכרים, הם מוגבלים לחקירות20,21.
בנוסף, מודלים אלה של בעלי חיים המשמשים לחקור את הפתוגנזה של מחלת העין היבשה לא סיפקו פרטים נאותים כדי לנתח את הזרוע החיסונית של ההפרעה הגורמת דלקת של פני העין. בהתאם לכך, מודל המורין של MGD שפותח על ידי Reyes et al. הראה קשר בין מחלת עיניים אלרגית בעכברים לבין MGD בבני אדם והדגיש את האטיולוגיה החיסונית האחראית ל-MGD21 חסימתי. מודל זה מקשר בין מחלת עיניים אלרגית לתגובת TH17 המגייסת נויטרופילים ללחמית ולעפעף, וגורמת ל-MGD ולדלקת עיניים כרונית21. האינדוקציה של MGD ודלקת עיניים במודל מורין זה היא כלי רב ערך לחקר אירועים במעלה הזרם במהלך התפתחות של דלקת מקומית המונעת על ידי תגובה חיסונית מתמשכת21. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את דלקת פני השטח של העין המלווה ב- MGD חסימתי. בשיטה זו, עכברים מחוסנים, ולאחר שבועיים, מאותגרים על פני השטח של העין עם האימונוגן במשך 7 ימים. יתר על כן, מתוארים הצעדים לבידוד הפרשת העיניים ואיברי העין הקשורים אליהם במהלך דלקת חריפה וכריתת הקרנית, הלחמית והעפעפיים.
ההפרשה השומנית של בלוטות Meibomian היא בעלת חשיבות רבה לעין בריאה22. עם זאת, החסימה של בלוטות החלב הללו על ידי מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות מצטברות (aggNETs) המיישרות קו כגדילים מקבילים הממוקמים על הלוחות הטרסליים של שני העפעפיים יכולה לשבש את סרט הדמעות23. הפרעה זו גורמ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) 2886 פרויקט PANDORA No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), פרויקט H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, ועל ידי קרן פולקסווגן (מענק 97744) ל- MH.
1x PBS | Gibco | ||
Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |