Oculaire oppervlakteontsteking schaadt de oculaire oppervlakteweefsels en compromitteert vitale functies van het oog. Het huidige protocol beschrijft een methode om oogontsteking te induceren en gecompromitteerde weefsels te verzamelen in een muismodel van Meibomian gland dysfunction (MGD).
Oculaire oppervlakteziekten omvatten een reeks aandoeningen die de functies en structuren van het hoornvlies, het bindvlies en het bijbehorende oculaire oppervlaktekliernetwerk verstoren. Meibomklieren (MG) scheiden lipiden af die een bedekkende laag creëren die de verdamping van het waterige deel van de traanfilm voorkomt. Neutrofielen en extracellulaire DNA-vallen bevolken MG en het oculaire oppervlak in een muismodel van allergische oogziekte. Geaggregeerde neutrofiele extracellulaire vallen (aggNETs) formuleren een mesh-achtige matrix bestaande uit extracellulair chromatine dat MG-uitgangen afsluit en MG-disfunctie conditioneert. Hier wordt een methode voor het induceren van oculaire oppervlakteontsteking en MG-disfunctie gepresenteerd. De procedures voor het verzamelen van organen die verband houden met het oculaire oppervlak, zoals het hoornvlies, bindvlies en oogleden, worden in detail beschreven. Met behulp van gevestigde technieken voor het verwerken van elk orgaan, worden ook de belangrijkste morfologische en histopathologische kenmerken van MG-disfunctie getoond. Oculaire exsudaten bieden de mogelijkheid om de ontstekingstoestand van het oculaire oppervlak te beoordelen. Deze procedures maken het onderzoek mogelijk naar actuele en systemische ontstekingsremmende interventies op preklinisch niveau.
Elke oogwenk vult de gladde traanfilm aan die over het hoornvlies is verspreid. De oculaire oppervlakte epithelia vergemakkelijkt de verdeling en juiste oriëntatie van de traanfilm op het oculaire oppervlak. Mucines worden geleverd door het hoornvlies en conjunctiva-epitheelcellen om het waterige deel van de traanfilm afkomstig van de traanklieren op het oogoppervlak te helpen positioneren. Ten slotte scheidt MG lipiden af die een bedekkende laag creëren die de verdamping van het waterige deel van de traanfilmvoorkomt 1,2,3. Op deze manier beschermen de gecoördineerde functies van alle oogorganen het oculaire oppervlak tegen binnendringende pathogenen of letsel en ondersteunen ze kristalhelder zicht zonder pijn of ongemak.
In een gezond oculair oppervlak veegt de oculaire vloeiende afscheiding of oogreum stof, dode epitheelcellen, bacteriën, slijm en immuuncellen weg. Geaggregeerde neutrofiele extracellulaire vallen (aggNETs) formuleren een mesh-achtige matrix bestaande uit extracellulair chromatine en nemen deze componenten op in het oogreum. AggNETs lossen ontstekingen op door de proteolytische afbraak van pro-inflammatoire cytokines en chemokines4. Wanneer ze echter disfunctioneel worden, drijven deze afwijkende aggNETs de pathogenese van ziekten zoals vasculaire occlusies in COVID-195, galstenen6 en sialolithiasis7. Evenzo spelen aggNETs op het oculaire oppervlak een beschermende rol en dragen ze bij aan het oplossen van ontstekingen van het sterk blootgestelde oppervlak8. Ofwel een overdreven vorming of gebrek aan aggNETs in het oogoppervlak kan de stabiliteit van de traanfilm aantasten en / of hoornvlieswonden, cicatriserende conjunctivitis en droge ogen veroorzaken. De obstructie van MG is bijvoorbeeld een belangrijke oorzaak van droge ogen9. Van AggNETs is ook bekend dat ze de stroom van lipidesecretie uit de kanalen van MG dichten en Meibomian gland dysfunction (MGD) veroorzaken. De congestie van MG-openingen door aggNETs veroorzaakt een gebrek aan vetvocht dat het oculaire oppervlak omhult en retrograde opgekropte vloeistof, wat resulteert in disfunctie van de klierfunctie en acinaire schade. Deze disfunctie kan leiden tot traanfilmverdamping, fibrose van de marges op de oogleden, oogontsteking en schadelijke schade aan de MG10,11.
In de loop der jaren zijn er verschillende diermodellen ontwikkeld om het pathologische proces van MGD bij mensen te imiteren. C57BL/6-muizen van 1 jaar hebben bijvoorbeeld geholpen bij het bestuderen van leeftijdsgerelateerde effecten op droge ogen (DED) en MGD, wat de oculaire ziektepathologie weerspiegelt bij patiënten van 50 jaar en oudervan 12,13,14 jaar. Bovendien zijn konijnen geschikte modellen voor het onderzoeken van de effecten van farmacologische interventies. Daarom is het induceren van MGD bij konijnen gemeld door de topische toediening van epinefrine of de systemische introductie van 13-cis-retinoïnezuur (isotretinoïne)15,16,17,18,19.
Hoewel deze diermodellen geschikt waren voor het bepalen van de verschillende factoren die bijdragen aan de pathofysiologie van MGD, waren ze beperkt in hun gebruik. Het muizenmodel van leeftijdsgebonden MGD was bijvoorbeeld ideaal voor het ontcijferen van elementen bij alleen oudere volwassenen, en daarom leken konijnen het meest geschikte diermodel om oculaire oppervlakteziekten te bestuderen, omdat ze het onderzoek van meerdere pathofysiologische mechanismen mogelijk maken. Vanwege het ontbreken van uitgebreide analytische hulpmiddelen om eiwitten aan het oculaire oppervlak te detecteren en omdat veel delen van het konijnengenoom niet zijn geannoteerd, zijn ze echter beperkt voor onderzoeken 20,21.
Bovendien leverden deze diermodellen die werden gebruikt om de pathogenese van droge ogen te onderzoeken, geen adequate details om de immunologische arm van de aandoening te analyseren die de ontsteking van het oculaire oppervlak veroorzaakt. Dienovereenkomstig toonde het muizenmodel van MGD ontwikkeld door Reyes et al. een verband tussen allergische oogziekte bij muizen en MGD bij mensen en benadrukte de immuunetiologie die verantwoordelijk is voor obstructieve MGD21. Dit model associeert allergische oogziekte met een TH17-respons die neutrofielen rekruteert naar het bindvlies en het ooglid, waardoor MGD en chronische oogontsteking ontstaat21. De inductie van MGD en oogontsteking in dit muizenmodel is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van stroomopwaartse gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling van lokale ontstekingen aangedreven door een voortdurende immuunrespons21. Het huidige protocol beschrijft de oculaire oppervlakteontsteking vergezeld van obstructieve MGD. Bij deze methode worden muizen geïmmuniseerd en na 2 weken gedurende 7 dagen uitgedaagd op het oculaire oppervlak met het immunogeen. Verder worden de stappen beschreven om oculair exsudaat en de bijbehorende oogorganen te isoleren tijdens acute ontsteking en de dissectie van het hoornvlies, bindvlies en oogleden.
De olieachtige afscheiding van de Meibomklieren is van groot belang voor een gezond oog22. De obstructie van deze talgklieren door geaggregeerde neutrofiele extracellulaire vallen (aggNETs) die zich op een rij opstellen als parallelle strengen op de tarsale platen van beide oogleden, kan echter de traanfilm verstoren23. Deze verstoring resulteert in Meibomian gland dysfunction (MGD)1 en versnelde traanverdamping en conditioneert de schade aan het ocu…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, en door de Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) aan MH.
1x PBS | Gibco | ||
Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |