Induzione dell'infiammazione della superficie oculare e raccolta dei tessuti coinvolti
Summary
L’infiammazione della superficie oculare danneggia i tessuti della superficie oculare e compromette le funzioni vitali dell’occhio. Il presente protocollo descrive un metodo per indurre l’infiammazione oculare e raccogliere i tessuti compromessi in un modello murino di disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD).
Abstract
Le malattie della superficie oculare comprendono una serie di disturbi che disturbano le funzioni e le strutture della cornea, della congiuntiva e della rete di ghiandole superficiali oculari associate. Le ghiandole di Meibomio (MG) secernono lipidi che creano uno strato di copertura che impedisce l’evaporazione della parte acquosa del film lacrimale. I neutrofili e le trappole del DNA extracellulare popolano la MG e la superficie oculare in un modello murino di malattia allergica dell’occhio. Le trappole extracellulari aggregate di neutrofili (aggNET) formulano una matrice simile a una maglia composta da cromatina extracellulare che occlude le prese di MG e condiziona la disfunzione della MG. Qui viene presentato un metodo per indurre l’infiammazione della superficie oculare e la disfunzione MG. Le procedure per la raccolta di organi relativi alla superficie oculare, come la cornea, la congiuntiva e le palpebre, sono descritte in dettaglio. Utilizzando tecniche consolidate per l’elaborazione di ciascun organo, vengono anche mostrate le principali caratteristiche morfologiche e istopatologiche della disfunzione MG. Gli essudati oculari offrono l’opportunità di valutare lo stato infiammatorio della superficie oculare. Queste procedure consentono lo studio di interventi antinfiammatori topici e sistemici a livello preclinico.
Introduction
Ogni battito di ciglia riempie il film lacrimale liscio disperso sulla cornea. Gli epiteli della superficie oculare facilitano la distribuzione e il corretto orientamento del film lacrimale sulla superficie oculare. Le mucine sono fornite dalla cornea e dalle cellule epiteliali congiuntiva per aiutare a posizionare la parte acquosa del film lacrimale proveniente dalle ghiandole lacrimali sulla superficie degli occhi. Infine, MG secerne lipidi che creano uno strato di copertura che impedisce l’evaporazione della parte acquosa del film lacrimale 1,2,3. In questo modo, le funzioni coordinate di tutti gli organi oculari proteggono la superficie oculare da agenti patogeni o lesioni invasori e supportano una visione cristallina senza alcun dolore o disagio.
In una superficie oculare sana, la scarica oculare o il reum oculare spazza via polvere, cellule epiteliali morte, batteri, muco e cellule immunitarie. Le trappole extracellulari di neutrofili aggregati (aggNET) formulano una matrice simile a una maglia composta da cromatina extracellulare e incorporano questi componenti nel reum dell’occhio. Gli AggNET risolvono l’infiammazione mediante la degradazione proteolitica di citochine e chemochine pro-infiammatorie4. Tuttavia, quando diventano disfunzionali, questi aggNET aberranti guidano la patogenesi di malattie come le occlusioni vascolari in COVID-195, calcoli biliari6 e sialolitiasi7. Allo stesso modo, gli aggNET sulla superficie oculare svolgono un ruolo protettivo e contribuiscono a risolvere l’infiammazione della superficie altamente esposta8. Una formazione esagerata o la mancanza di aggNET nella superficie oculare possono compromettere la stabilità del film lacrimale e / o causare ferite corneali, congiuntivite cicatrizzante e malattia dell’occhio secco. Ad esempio, l’ostruzione della MG è una delle principali cause di malattia dell’occhio secco9. Gli AggNET sono anche noti per tappare il flusso di secrezione lipidica dai dotti di MG e causare la disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD). La congestione degli orifizi MG da parte di aggNET provoca una mancanza di fluido grasso che avvolge la superficie oculare e il fluido imbottigliato retrogrado, con conseguente disfunzione della funzione ghiandolare e danni acinosi. Questa disfunzione può provocare evaporazione del film lacrimale, fibrosi dei margini sulle palpebre, infiammazione oculare e danni dannosi alla MG10,11.
Diversi modelli animali sono stati sviluppati nel corso degli anni per imitare il processo patologico della MGD nell’uomo. Ad esempio, topi C57BL / 6 di età pari o superiore a 1 anno hanno contribuito a studiare gli effetti legati all’età sulla malattia dell’occhio secco (DED) e MGD, riflettendo la patologia della malattia oculare in pazienti di età pari o superiore a 50 anni12,13,14. Inoltre, i conigli sono modelli appropriati per studiare gli effetti degli interventi farmacologici. Pertanto, l’induzione di MGD nei conigli è stata riportata sia dalla somministrazione topica di adrenalina che dall’introduzione sistemica di acido 13-cis-retinoico (isotretinoina)15,16,17,18,19.
Sebbene questi modelli animali fossero adeguati per determinare i diversi fattori che contribuiscono alla fisiopatologia della MGD, erano limitati nel loro utilizzo. Ad esempio, il modello murino di MGD legata all’età era ideale per decifrare elementi solo negli anziani e, quindi, i conigli sembravano essere il modello animale più adatto per studiare le malattie della superficie oculare, in quanto consentono lo studio di molteplici meccanismi fisiopatologici. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti analitici completi per rilevare le proteine sulla superficie oculare e poiché molte parti del genoma del coniglio non sono annotate, sono limitate per le indagini20,21.
Inoltre, questi modelli animali utilizzati per studiare la patogenesi della malattia dell’occhio secco non hanno fornito dettagli adeguati per analizzare il braccio immunologico del disturbo che istiga l’infiammazione della superficie oculare. Di conseguenza, il modello murino di MGD sviluppato da Reyes et al. ha mostrato un’associazione tra malattia allergica dell’occhio nei topi e MGD nell’uomo e ha evidenziato l’eziologia immunitaria responsabile della MGD21 ostruttiva. Questo modello associa la malattia allergica dell’occhio con una risposta TH17 che recluta neutrofili alla congiuntiva e alla palpebra, causando MGD e infiammazione oculare cronica21. L’induzione della MGD e dell’infiammazione oculare in questo modello murino è uno strumento prezioso per studiare gli eventi a monte durante lo sviluppo dell’infiammazione locale guidata da una risposta immunitaria in corso21. L’attuale protocollo descrive l’infiammazione della superficie oculare accompagnata da MGD ostruttiva. In questo metodo, i topi vengono immunizzati e, dopo 2 settimane, sfidati sulla superficie oculare con l’immunogeno per 7 giorni. Inoltre, vengono descritti i passaggi per isolare l’essudato oculare e gli organi oculari associati durante l’infiammazione acuta e la dissezione della cornea, della congiuntiva e delle palpebre.
Protocol
Representative Results
Discussion
La secrezione oleosa delle ghiandole di Meibomio è di grande importanza per un occhio sano22. Tuttavia, l’ostruzione di queste ghiandole sebacee da parte di trappole extracellulari di neutrofili aggregati (aggNET) che si allineano come filamenti paralleli situati sulle placche tarsali di entrambe le palpebre può interrompere il film lacrimale23. Questa interruzione provoca disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD)1 e un’evaporazione lacrimale a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, e dalla Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) a MH.
Materials
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
Riferimenti
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