안구 표면 염증의 유도 및 관련 조직의 수집
Summary
안구 표면 염증은 안구 표면 조직에 해를 끼치고 눈의 중요한 기능을 손상시킵니다. 본 프로토콜은 마이보미안 샘 기능장애(MGD)의 마우스 모델에서 안구 염증을 유도하고 손상된 조직을 수집하는 방법을 기술한다.
Abstract
안구 표면 질환에는 각막, 결막 및 관련 안구 표면 샘 네트워크의 기능과 구조를 방해하는 다양한 장애가 포함됩니다. Meibomian 땀샘 (MG)은 눈물 막의 수성 부분의 증발을 방지하는 덮개 층을 만드는 지질을 분비합니다. 호중구와 세포외 DNA 트랩은 알레르기성 안구 질환의 마우스 모델에서 MG와 안구 표면을 채웁니다. 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)은 MG 출구를 차단하고 MG 기능 장애를 조절하는 세포외 염색질로 구성된 메쉬 모양의 매트릭스를 공식화합니다. 여기서, 안구 표면 염증 및 MG 기능 장애를 유도하는 방법이 제시된다. 각막, 결막 및 눈꺼풀과 같은 안구 표면과 관련된 장기를 수집하는 절차가 자세히 설명되어 있습니다. 각 장기를 처리하기 위해 확립 된 기술을 사용하여 MG 기능 장애의 주요 형태 학적 및 조직 병리학 적 특징도 보여줍니다. 안구 삼출물은 안구 표면의 염증 상태를 평가할 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 절차를 통해 전임상 수준에서 국소 및 전신 항염증 중재를 조사할 수 있습니다.
Introduction
눈 깜짝 할 사이에 각막 위에 흩어져있는 부드러운 눈물 막이 보충됩니다. 안구 표면 상피는 안구 표면에서 눈물 막의 분포와 올바른 방향을 촉진합니다. 뮤신은 각막과 결막 상피 세포에 의해 제공되어 눈물샘에서 나오는 눈물막의 수성 부분을 눈 표면에 위치시키는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, MG는 눈물막 1,2,3의 수성 부분의 증발을 방지하는 피복층을 생성하는 지질을 분비합니다. 이러한 방식으로 모든 안구 기관의 조정 된 기능은 침입 병원균이나 부상으로부터 안구 표면을 보호하고 통증이나 불편 함없이 맑은 시력을 지원합니다.
건강한 안구 표면에서 안구 흐르는 분비물 또는 눈 류움은 먼지, 죽은 상피 세포, 박테리아, 점액 및 면역 세포를 쓸어냅니다. 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)은 세포외 염색질로 구성된 메쉬 모양의 매트릭스를 공식화하고 이러한 구성 요소를 눈 류움에 통합합니다. AggNET은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 단백질 분해 분해에 의해 염증을 해결합니다4. 그러나 기능 장애가 발생하면 이러한 비정상적인 aggNET은 COVID-195, 담석6 및 규석결석 7의 혈관 폐색과 같은 질병의 발병 기전을 유발합니다. 유사하게, 안구 표면의 aggNET은 보호 역할을하며 고도로 노출 된 표면의 염증을 해결하는 데 기여합니다8. 안구 표면에 과장된 형성 또는 aggNET이 부족하면 눈물막 안정성이 손상되거나 각막 상처, 결막염 및 안구 건조증을 유발할 수 있습니다. 예를 들어, MG의 폐색은 안구 건조증의 주요 원인입니다9. AggNET은 또한 MG의 덕트에서 지질 분비의 흐름을 막고 마이봄샘 기능 장애(MGD)를 유발하는 것으로 알려져 있습니다. aggNET에 의한 MG 오리피스의 혼잡은 안구 표면을 감싸는 지방액의 부족과 역행 병액 체액을 유발하여 샘 기능의 기능 장애 및 acinar 손상을 초래합니다. 이 기능 장애는 눈물막 증발, 눈꺼풀 가장자리의 섬유증, 눈 염증 및 MG10,11에 대한 해로운 손상을 초래할 수 있습니다.
인간에서 MGD의 병리학 적 과정을 모방하기 위해 수년에 걸쳐 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 예를 들어, 1 세의 C57BL / 6 마우스는 50 세 이상 환자의 안구 질환 병리를 반영하여 안구 건조증 (DED) 및 MGD에 대한 연령 관련 효과를 연구하는 데 도움이되었습니다12,13,14. 또한, 토끼는 약리학 적 개입의 효과를 조사하기위한 적절한 모델이다. 따라서 토끼에서 MGD를 유도하는 것은 에피네프린의 국소 투여 또는 13-시스-레티노산(isotretinoin)15,16,17,18,19의 전신 도입에 의해 보고되었습니다.
이러한 동물 모델은 MGD의 병태생리학에 기여하는 다양한 요인을 결정하는 데 적합했지만 활용이 제한적이었습니다. 예를 들어, 연령 관련 MGD의 쥐 모델은 노인의 요소를 해독하는 데 이상적이었고, 따라서 토끼는 여러 병리 생리 학적 메커니즘을 조사 할 수 있기 때문에 안구 표면 질환을 연구하는 데 가장 적합한 동물 모델 인 것으로 나타났습니다. 그러나 안구 표면에서 단백질을 검출하기위한 포괄적 인 분석 도구가 부족하고 토끼 게놈의 많은 부분에 주석이 없기 때문에 조사20,21로 제한됩니다.
또한, 안구건조증의 발병기전을 조사하기 위해 사용된 이들 동물 모델은 안구 표면의 염증을 유발하는 장애의 면역학적 팔을 분석하기 위한 적절한 세부사항을 제공하지 않았다. 따라서, Reyes 등에 의해 개발된 MGD의 뮤린 모델은 마우스의 알레르기성 안구 질환과 인간의 MGD 사이의 연관성을 보여주었고, 폐쇄성 MGD21의 원인이 되는 면역 병인을 강조하였다. 이 모델은 알레르기 성 안 질환을 결막과 눈꺼풀에 호중구를 모집하여 MGD 및 만성 안구 염증21을 유발하는 TH17 반응과 연관시킵니다. 이 뮤린 모델에서 MGD 및 안구 염증의 유도는 진행중인 면역 반응21에 의해 구동되는 국소 염증의 발달 동안 상류 사건을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 현재 프로토콜은 폐쇄성 MGD를 동반하는 안구 표면 염증을 설명합니다. 이 방법에서, 마우스는 면역화되고, 2 주 후, 7 일 동안 면역원으로 안구 표면에 도전된다. 또한 급성 염증 및 각막, 결막 및 눈꺼풀 박리 동안 안구 삼출물 및 관련 안구 기관을 분리하는 단계가 설명됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meibomian 땀샘의 기름진 분비는 건강한 눈22에 매우 중요합니다. 그러나, 양쪽 눈꺼풀의 족근판에 위치한 평행 가닥으로서 정렬된 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)에 의한 이들 피지선의 막힘은 눈물막(23)을 파괴할 수 있다. 이러한 파괴는 마이보미안 샘 기능 장애(MGD)1 를 초래하고 눈물 증발을 가속화하고 안구 표면의 손상을…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 독일 연구 재단 (DFG) 2886 PANDORA 프로젝트 No.B3의 일부 지원을 받았습니다. 샤 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181 (C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 프로젝트 861878 및 폭스바겐-재단(보조금 97744)에서 MH로.
Materials
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
Riferimenti
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