Okulær overflatebetennelse skader det okulære overflatevevet og kompromitterer vitale funksjoner i øyet. Den nåværende protokollen beskriver en metode for å indusere okulær betennelse og samle kompromittert vev i en musemodell av Meibomian kjertel dysfunksjon (MGD).
Okulære overflatesykdommer inkluderer en rekke lidelser som forstyrrer funksjonene og strukturene i hornhinnen, bindehinden og det tilhørende okulære overflatekjertelnettverket. Meibomske kjertler (MG) utskiller lipider som skaper et dekklag som forhindrer fordampning av den vandige delen av tårefilmen. Neutrofiler og ekstracellulære DNA-feller befolker MG og den okulære overflaten i en musemodell av allergisk øyesykdom. Aggregerte nøytrofile ekstracellulære feller (aggNETs) formulerer en maskelignende matrise sammensatt av ekstracellulær kromatin som okkluderer MG-uttak og betingelser MG dysfunksjon. Her presenteres en metode for å indusere okulær overflatebetennelse og MG-dysfunksjon. Prosedyrene for å samle organer relatert til okulær overflate, som hornhinnen, bindehinden og øyelokkene, er beskrevet i detalj. Ved hjelp av etablerte teknikker for behandling av hvert organ, vises også de viktigste morfologiske og histopatologiske egenskapene til MG-dysfunksjon. Okulære ekssudater gir mulighet til å vurdere den inflammatoriske tilstanden til den okulære overflaten. Disse prosedyrene muliggjør undersøkelse av aktuelle og systemiske antiinflammatoriske inngrep på preklinisk nivå.
Hvert øyeblikk fyller på den glatte tårefilmen spredt over hornhinnen. Det okulære overflateepitelet letter fordelingen og korrekt orientering av tårfilmen på okulæroverflaten. Muciner er tilveiebrakt av hornhinnen og konjunktivepitelceller for å hjelpe til med å plassere den vandige delen av tårefilmen som kommer fra lacrimalkjertlene på øynenees overflate. Til slutt utskiller MG lipider som skaper et dekklag som forhindrer fordampning av den vandige delen av tårefilmen 1,2,3. På denne måten beskytter de koordinerte funksjonene til alle okulære organer den okulære overflaten mot invaderende patogener eller skader og støtter krystallklart syn uten smerte eller ubehag.
I en sunn okulær overflate feier den okulære flytende utslipp eller øye rheum bort støv, døde epitelceller, bakterier, slim og immunceller. Aggregerte nøytrofile ekstracellulære feller (aggNETs) formulerer en maskelignende matrise sammensatt av ekstracellulær kromatin og inkorporerer disse komponentene i øyets rheum. AggNETs løser betennelse ved proteolytisk nedbrytning av proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner4. Men når de blir dysfunksjonelle, driver disse avvikende aggNETene patogenesen av sykdommer som vaskulære okklusjoner i COVID-195, gallestein6 og sialolithiasis7. På samme måte spiller aggNETs på den okulære overflaten en beskyttende rolle og bidrar til å løse betennelse i den svært eksponerte overflaten8. Enten en overdrevet formasjon eller mangel på aggNETs i okulær overflate kan svekke tårefilmens stabilitet og / eller forårsake hornhinnenesår, cicatrizing konjunktivitt og tørr øyesykdom. For eksempel er obstruksjon av MG en ledende årsak til tørr øyesykdom9. AggNETs er også kjent for å plugge strømmen av lipidsekresjon fra kanalene til MG og forårsake Meibomian kjertel dysfunksjon (MGD). Overbelastning av MG-åpninger av aggNETs forårsaker mangel på fettvæske som omslutter okulær overflate og retrograd flaskevæske, noe som resulterer i dysfunksjon av kjertelfunksjonen og acinarskader. Denne dysfunksjonen kan resultere i tårefilmfordampning, fibrose i kantene på øyelokkene, øyebetennelse og skadelig skade på MG10,11.
Flere dyremodeller har blitt utviklet gjennom årene for å etterligne den patologiske prosessen med MGD hos mennesker. For eksempel har C57BL / 6 mus i alderen 1 år bidratt til å studere aldersrelaterte effekter på tørr øyesykdom (DED) og MGD, noe som gjenspeiler den okulære sykdomspatologien hos pasienter i alderen 50 år og eldre12,13,14. Videre er kaniner egnede modeller for å undersøke effekten av farmakologiske tiltak. Induserende MGD hos kaniner er derfor rapportert enten ved topikal administrering av adrenalin eller systemisk innføring av 13-cis-retinsyre (isotretinoin)15,16,17,18,19.
Selv om disse dyremodellene var tilstrekkelige for å bestemme de ulike faktorene som bidrar til patofysiologien til MGD, var de begrenset i bruken. For eksempel var murine-modellen for aldersrelatert MGD ideell for å dechiffrere elementer bare hos eldre voksne, og derfor syntes kaniner å være den mest egnede dyremodellen for å studere okulære overflatesykdommer, da de muliggjør undersøkelse av flere patofysiologiske mekanismer. På grunn av mangel på omfattende analyseverktøy for å oppdage proteiner på okulær overflate og fordi mange deler av kaningenomet ikke er kommentert, er de imidlertid begrenset for undersøkelser20,21.
I tillegg ga disse dyremodellene som ble brukt til å undersøke patogenesen av tørr øyesykdom ikke tilstrekkelige detaljer for å analysere den immunologiske armen av lidelsen som fremkaller betennelsen i den okulære overflaten. Følgelig viste murine modellen av MGD utviklet av Reyes et al. en sammenheng mellom allergisk øyesykdom hos mus og MGD hos mennesker og fremhevet immunetiologien som er ansvarlig for obstruktiv MGD21. Denne modellen forbinder allergisk øyesykdom med en TH17-respons som rekrutterer nøytrofiler til bindehinden og øyelokket, noe som forårsaker MGD og kronisk okulær betennelse21. Induksjonen av MGD og okulær betennelse i denne murine modellen er et verdifullt verktøy for å undersøke oppstrøms hendelser under utvikling av lokal betennelse drevet av en pågående immunrespons21. Den nåværende protokollen beskriver okulær overflatebetennelse ledsaget av obstruktiv MGD. I denne metoden immuniseres mus og etter 2 uker utfordres på okulær overflate med immunogen i 7 dager. Videre beskrives trinnene for å isolere okulært ekssudat og tilhørende okulære organer under akutt betennelse og disseksjon av hornhinnen, bindehinnen og øyelokkene.
Den oljeaktige sekresjonen av Meibomian kjertlene er av stor betydning for et sunt øye22. Imidlertid kan obstruksjonen av disse talgkjertlene av aggregerte nøytrofile ekstracellulære feller (aggNETs) som stiller opp som parallelle tråder plassert på tarsalplatene i begge øyelokkene, forstyrre tårefilmen23. Denne forstyrrelsen resulterer i meibomisk kjerteldysfunksjon (MGD)1 og akselerert tårefordampning og betinger skaden på den okulære ove…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av German Research Foundation (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, og av Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) til MH.
1x PBS | Gibco | ||
Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |