Mycobacterium tuberkulose Ekstracellulær vesikelberigelse gennem størrelsesekskluderingskromatografi
Summary
Denne protokol beskriver størrelsesekskluderende kromatografi, en letkøbt og reproducerbar teknik til berigelse af Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler fra kultursupernatanter.
Abstract
Den rolle, som ekstracellulære vesikler (EV’er) spiller i forbindelse med bakteriel infektion, er opstået som en ny vej til forståelse af mikrobiel fysiologi. Specifikt spiller Mycobacterium tuberculosis (Mtb) elbiler en rolle i værtspatogeninteraktionen og reaktionen på miljøstress. Mtb-elbiler er også meget antigene og viser potentiale som vaccinekomponenter. Den mest almindelige metode til rensning af Mtb-elbiler er densitetsgradient ultracentrifugering. Denne proces har flere begrænsninger, herunder lav gennemstrømning, lavt udbytte, afhængighed af dyrt udstyr, tekniske udfordringer, og det kan påvirke den resulterende forberedelse negativt. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) er en blidere alternativ metode, der bekæmper mange af begrænsningerne ved ultracentrifugering. Denne protokol viser, at SEC er effektiv til Mtb EV-berigelse og producerer Mtb EV-præparater af høj kvalitet med øget udbytte på en hurtig og skalerbar måde. Derudover viser en sammenligning med densitetsgradient ultracentrifugering ved kvantificerings- og kvalifikationsprocedurer fordelene ved SEC. Mens evalueringen af EV-mængde (nanopartikelsporingsanalyse), fænotype (transmissionselektronmikroskopi) og indhold (Western blotting) er skræddersyet til Mtb-elbiler, kan den leverede arbejdsgang anvendes på andre mykobakterier.
Introduction
Ekstracellulær vesikel (EV) frigivelse af patogener kan være nøglen til at låse op for nye teknologier til bekæmpelse af infektionssygdomme1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen med høj konsekvens, der inficerer ca. en tredjedel af verdens befolkning og kræver millioner af menneskers liv hvert år2. Ev-produktion af Mtb er veldokumenteret, men undvigende i biogenesen og forskellige roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern- og næringsstofopsamling) af disse elbiler i forbindelse med infektion 3,4,5. Bestræbelser på at forstå sammensætningen af Mtb-elbiler afslørede 50-150 nm lipidmembran-lukkede kugler afledt af plasmamembranen indeholdende lipider og proteiner af immunologisk betydning 3,6. Undersøgelse af Mtb-elbilers rolle i bakteriel fysiologi har afsløret betydningen af bakteriel EV-modulering som reaktion på miljøbelastning for overlevelse5. Værtspatogen-interaktionsundersøgelser har været mere komplicerede at fortolke, men beviser tyder på, at Mtb-elbiler kan påvirke værtens immunrespons og potentielt kan tjene som en effektiv vaccinationskomponent 3,4,7.
De fleste undersøgelser af Mtb-elbiler hidtil har været afhængige af densitetsgradient ultracentrifugering til vesikelberigelse8. Dette har været effektivt for mindre undersøgelser; Denne teknik har dog flere tekniske og logistiske udfordringer. Alternative arbejdsgange kobler flertrinscentrifugering til fjernelse af hele celler og stort affald med et sidste ultracentrifugeringstrin til pellet-elbiler. Denne metode kan variere i effektivitet og resulterer ofte i lavt udbytte og co-oprensning af opløselige ikke-vesikelassocierede biomolekyler, samtidig med at den påvirker vesikelintegriteten9. Derudover er denne proces tidskrævende, manuelt intensiv og meget begrænset i gennemstrømning på grund af udstyrsbegrænsninger.
Den nuværende protokol beskriver en alternativ teknik til densitetsgradient ultracentrifugering: størrelsesekskluderingskromatografi (SEC). Denne metode er demonstreret for miljømykobakterier, og i det aktuelle arbejde er den ekstrapoleret til Mtb10. En kommercielt tilgængelig søjle- og automatisk brøkopsamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og reducere behovet for specifikt, dyrt udstyr. Det er også muligt at fuldføre denne protokol på en brøkdel af tiden sammenlignet med densitetsgradient ultracentrifugering, hvilket øger gennemstrømningen. Denne teknik er mindre teknisk udfordrende, hvilket gør det lettere at mestre og kan øge reproducerbarheden mellem / intralaboratoriet. Endelig har SEC høj separationseffektivitet og er skånsom og bevarer vesiklernes integritet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler er meget antigene reservoirer, som præsenterer dem som en attraktiv vej til udvikling af diagnostiske værktøjer og fremtidige vacciner 4,19,20. Historisk set er densitetsgradient ultracentrifugering blevet brugt til at adskille Mtb-elbiler fra andet opløseligt, udskilt materiale8. Selvom denne proces er effektiv, er den også tidskrævende,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende støtte fra College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award og College Research Council Shared Research Program til NKG og finansiering fra ATCC (pris nr. 2016-0550-0002) til KMD. Vi vil også gerne anerkende Anne Simpson for teknisk support og BEI Resources, NIAID, NIH for følgende reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produceret in vitro), NR-13792, Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produceret in vitro), NR-49223 og Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produceret in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Riferimenti
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
