المتفطرة السلية إثراء الحويصلات خارج الخلية من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
Summary
يصف هذا البروتوكول كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وهي تقنية سهلة وقابلة للتكرار لإثراء المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية من supernatants الثقافة.
Abstract
ظهر دور الحويصلات خارج الخلية (EVs) في سياق العدوى البكتيرية كوسيلة جديدة لفهم فسيولوجيا الميكروبات. على وجه التحديد ، تلعب المركبات الكهربائية المتفطرة السلية (Mtb) دورا في التفاعل بين المضيف والممرض والاستجابة للإجهاد البيئي. كما أن المركبات الكهربائية Mtb مستضدية للغاية وتظهر إمكانات كمكونات للقاح. الطريقة الأكثر شيوعا لتنقية المركبات الكهربائية Mtb هي الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه العملية لها العديد من القيود ، بما في ذلك الإنتاجية المنخفضة ، والعائد المنخفض ، والاعتماد على المعدات باهظة الثمن ، والتحديات التقنية ، ويمكن أن تؤثر سلبا على التحضير الناتج. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) هي طريقة بديلة ألطف تحارب العديد من قيود الطرد المركزي الفائق. يوضح هذا البروتوكول أن SEC فعالة في إثراء Mtb EV وتنتج مستحضرات Mtb EV عالية الجودة لزيادة الإنتاجية بطريقة سريعة وقابلة للتطوير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقارنة مع الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة من خلال إجراءات القياس الكمي والتأهيل توضح فوائد SEC. في حين أن تقييم كمية EV (تحليل تتبع الجسيمات النانوية) ، والنمط الظاهري (المجهر الإلكتروني للإرسال) ، والمحتوى (النشاف الغربي) مصمم خصيصا ل Mtb EVs ، يمكن تطبيق سير العمل المقدم على المتفطرات الأخرى.
Introduction
قد يكون إطلاق الحويصلة خارج الخلية (EV) بواسطة مسببات الأمراض هو المفتاح لفتح تقنيات جديدة للسيطرة على الأمراض المعدية1. المتفطرة السلية (Mtb) هي عامل ممرض ذو عواقب عالية ، حيث تصيب ما يقرب من ثلث سكان العالم وتودي بحياة الملايين من الناس كل عام2. إنتاج EV بواسطة Mtb موثق جيدا ولكنه بعيد المنال في التكوين الحيوي والأدوار المتنوعة (أي المحفزات المناعية ، المثبطة للمناعة ، اكتساب الحديد والمغذيات) لهذه المركبات الكهربائية في سياق العدوى3،4،5. كشفت الجهود المبذولة لفهم تكوين Mtb EVs عن 50-150 نانومتر من الكرات المغلقة بالغشاء الدهني المشتقة من غشاء البلازما الذي يحتوي على الدهون والبروتينات ذات الأهمية المناعية 3,6. كشف التحقيق في دور Mtb EVs في علم وظائف الأعضاء البكتيرية عن أهمية تعديل EV البكتيري استجابة للإجهاد البيئي للبقاء على قيد الحياة5. كانت دراسات التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض أكثر تعقيدا في تفسيرها ، لكن الأدلة تشير إلى أن Mtb EVs يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية للمضيف وقد تكون بمثابة مكون تطعيم فعال 3,4,7.
اعتمدت معظم الدراسات التي أجريت على المركبات الكهربائية Mtb حتى الآن على الطرد المركزي المتدرج للكثافة لتخصيب الحويصلة8. وكان ذلك فعالا بالنسبة للدراسات الصغيرة النطاق؛ ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لديها العديد من التحديات التقنية واللوجستية. تجمع مهام سير العمل البديلة بين الطرد المركزي متعدد الخطوات ، لإزالة الخلايا الكاملة والحطام الكبير ، مع خطوة الطرد المركزي الفائق النهائية لتكوير المركبات الكهربائية. يمكن أن تختلف هذه المنهجية في الكفاءة ، وغالبا ما تؤدي إلى انخفاض الغلة والتنقية المشتركة للجزيئات الحيوية غير الحويصلة القابلة للذوبان مع التأثير أيضا على سلامة الحويصلة9. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ومكثفة يدويا ومحدودة للغاية في الإنتاجية بسبب قيود المعدات.
يصف البروتوكول الحالي تقنية بديلة للطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة: كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). وقد تم إثبات هذه الطريقة للمتفطرات البيئية ، وفي العمل الحالي ، تم استقرائها إلى Mtb10. يمكن للعمود المتاح تجاريا وجامع الكسور التلقائي تحسين الاتساق في التحضير الحويصلي وتقليل الحاجة إلى معدات محددة ومكلفة. من الممكن أيضا إكمال هذا البروتوكول في جزء صغير من الوقت مقارنة بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، مما يزيد من الإنتاجية. هذه التقنية أقل تحديا من الناحية الفنية ، مما يجعل من السهل إتقانها ، ويمكن أن تزيد من قابلية التكرار بين / داخل المختبر. أخيرا ، تتمتع SEC بكفاءة فصل عالية وهي لطيفة ، مما يحافظ على سلامة الحويصلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية هي خزانات مستضدية للغاية ، والتي تقدمها كوسيلة جذابة لتطوير أدوات التشخيص واللقاحات المستقبلية4،19،20. تاريخيا ، تم استخدام الطرد المركزي الفائق التدرج للكثافة لفصل Mtb EVs عن المواد الأخرى القابل?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشيد بالدعم المقدم من الجائزة التجريبية لكلية الطب البيطري والعلوم الطبية الحيوية وبرنامج البحوث المشتركة لمجلس أبحاث الكلية إلى NKG والتمويل المقدم من ATCC (الجائزة رقم 2016-0550-0002) إلى KMD. نود أيضا أن نشيد بآن سيمبسون على الدعم الفني و BEI Resources و NIAID و NIH على الكواشف التالية: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) ، IT-54 (المنتجة في المختبر) ، NR-13792 ، Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c) ، Clone IT-3 (SA-12) (المنتجة في المختبر) ، NR-49223 ، و Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM ، Clone CS-35 (المنتجة في المختبر) ، NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Riferimenti
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
