마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축
Summary
이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.
Abstract
박테리아 감염의 맥락에서 세포 밖 소포 (EVs)의 역할은 미생물 생리학을 이해하기위한 새로운 길로 부상했습니다. 구체적으로, 결핵균 (Mtb) EVs는 숙주-병원체 상호작용 및 환경 스트레스에 대한 반응에서 역할을 한다. Mtb EV는 또한 항원성이 높으며 백신 성분으로서의 잠재력을 보여줍니다. Mtb EV를 정제하는 가장 일반적인 방법은 밀도 구배 초원심분리입니다. 이 프로세스에는 낮은 처리량, 낮은 수율, 고가의 장비에 대한 의존도, 기술적 과제 등 몇 가지 제한 사항이 있으며 결과 준비에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 초원심분리의 많은 한계에 대처하는 온화한 대안 방법입니다. 이 프로토콜은 SEC가 Mtb EV 농축에 효과적이며 신속하고 확장 가능한 방식으로 수율 증가의 고품질 Mtb EV 제제를 생산한다는 것을 보여줍니다. 또한, 정량화 및 검증 절차에 의한 밀도 구배 초원심분리와의 비교는 SEC의 이점을 입증합니다. EV 수량 (나노입자 추적 분석), 표현형 (투과 전자 현미경) 및 함량 (웨스턴 블롯팅)의 평가는 Mtb EV에 맞게 조정되지만 제공된 워크 플로는 다른 마이코 박테리아에 적용될 수 있습니다.
Introduction
병원균에 의한 세포밖 소포(EV) 방출은 감염성 질환을 통제하기 위한 새로운 기술을 잠금 해제하는 열쇠가 될 수 있다1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb)는 세계 인구의 약 삼분의 일을 감염시키고 매년 수백만 명의 사람들의 생명을 앗아가는 높은 결과의 병원체입니다2. Mtb에 의한 EV 생산은 감염 3,4,5의 맥락에서 이들 EVs의 생물발생 및 다양한 역할(즉, 면역자극성, 면역억제, 철분 및 영양소 획득)에서 애매하면서도 잘 문서화되어 있다. Mtb EVs의 조성을 이해하려는 노력은 면역학적 유의성의 지질 및 단백질을 함유하는 원형질막으로부터 유래된 50-150 nm 지질막-밀폐된 구체를 밝혀냈다 3,6. 박테리아 생리학에서 Mtb EVs의 역할에 대한 조사는 생존을 위한 환경 스트레스에 반응하여 박테리아 EV 조절의 중요성을 밝혀냈다 5. 숙주-병원체 상호작용 연구는 해석하기가 더 복잡하지만, 증거는 Mtb EV가 숙주의 면역 반응에 영향을 미칠 수 있고 잠재적으로 효과적인 백신 접종 성분 3,4,7로서 작용할 수 있음을 나타낸다.
지금까지 Mtb EV에 대한 대부분의 연구는 소낭 농축을위한 밀도 구배 초원심분리에 의존했습니다8. 이것은 소규모 연구에 효과적이었습니다. 그러나이 기술에는 몇 가지 기술적 및 물류 문제가 있습니다. 대체 워크플로우는 전체 세포와 큰 파편을 제거하기 위해 다단계 원심분리를 결합하고 EV를 펠릿화하는 최종 초원심분리 단계를 거칩니다. 이러한 방법론은 효율성이 다양할 수 있으며, 종종 소낭 완전성에 영향을 미치는 동시에 가용성 비소포 관련 생체분자의 낮은 수율 및 공동 정제를 초래한다(9). 또한 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 수동으로 집약적이며 장비 제약으로 인해 처리량이 매우 제한적입니다.
본 프로토콜은 밀도 구배 초원심분리에 대한 대안적인 기술: 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 기술한다. 이 방법은 환경 마이코 박테리아에 대해 입증되었으며, 현재 연구에서 Mtb10으로 외삽되었습니다. 시판되는 컬럼 및 자동 분획 콜렉터는 소포 준비의 일관성을 향상시키고 특정하고 값 비싼 장비에 대한 필요성을 줄일 수 있습니다. 또한, 밀도 구배 초원심분리에 비해 시간의 일부분으로 이 프로토콜을 완료하여, 처리량을 증가시킬 수 있다. 이 기술은 기술적으로 덜 도전적이어서 마스터하기가 더 쉬워지고 실험실 간 / 실험실 내 재현성을 높일 수 있습니다. 마지막으로, SEC는 높은 분리 효율을 가지며 부드럽고 소포의 무결성을 보존합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마이코박테리움 결핵 세포밖 소포는 항원성이 높은 저장소로, 진단 도구 및 미래 백신 4,19,20 개발을 위한 매력적인 길로 제시됩니다. 역사적으로, 밀도 구배 초원심분리는 Mtb EV를 다른 용해성, 분비 물질(8)로부터 분리하는데 사용되어 왔다. 이 공정은 효과적이지만, 또한 시간이 많이 걸리고, 기술적으…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 수의학 및 생물 의학 과학 체험 상 및 대학 연구위원회 공유 연구 프로그램의 지원을 NKG에 지원하고 ATCC (상 # 2016-0550-0002)가 KMD에 자금을 지원한다는 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 Anne Simpson에게 기술 지원 및 BEI Resources, NIAID, NIH의 다음 시약을 인정하고 싶습니다 : 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 LpqH (유전자 Rv3763), IT-54 (시험관 내에서 생산), NR-13792, 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 GroES (유전자 Rv3418c), 클론 IT-3 (SA-12) (시험관 내에서 생산), NR-49223 및 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 LAM, 클론 CS-35 (시험관 내에서 생산), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Riferimenti
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