Il presente protocollo descrive la microscopia fluorescente a foglio luminoso e metodi automatizzati assistiti da software per visualizzare e quantificare con precisione i parassiti proliferanti e dormienti del Trypanosoma cruzi e le cellule T in organi e tessuti intatti e cancellati. Queste tecniche forniscono un modo affidabile per valutare i risultati del trattamento e offrono nuove informazioni sulle interazioni parassita-ospite.
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Articolo metodologico
Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia di Chagas è una patologia trascurata che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, principalmente in America Latina. L'agente della malattia di Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), è un parassita intracellulare obbligato con una biologia diversificata che infetta diverse specie di mammiferi, compresi gli esseri umani, causando patologie cardiache e digestive. Il rilevamento affidabile delle infezioni in vivo da T. cruzi è stato a lungo necessario per comprendere la complessa biologia della malattia di Chagas e valutare accuratamente l'esito dei regimi di trattamento. L'attuale protocollo dimostra una pipeline integrata per la quantificazione automatizzata delle cellule infette da T. cruzi in organi ricostruiti in 3D e cancellati. La microscopia fluorescente a foglio luminoso consente di visualizzare e quantificare con precisione i parassiti T. cruzi attivamente proliferanti e dormienti e le cellule effettrici immunitarie in interi organi o tessuti. Inoltre, è stata adottata con successo la pipeline CUBIC-HistoVision per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. La pulizia dei tessuti accoppiata con l'immunocolorazione 3D fornisce un approccio imparziale per valutare in modo completo i protocolli di trattamento farmacologico, migliorare la comprensione dell'organizzazione cellulare dei tessuti infetti da T. cruzi e si prevede che farà avanzare le scoperte relative alle risposte immunitarie anti-T. cruzi, al danno tissutale e alla riparazione nella malattia di Chagas.
Introduzione
La malattia di Chagas, causata dal parassita protozoo T. cruzi, è tra le malattie tropicali più trascurate al mondo, causando circa 13.000 morti all'anno. L'infezione spesso progredisce da uno stadio acuto a uno cronico producendo patologia cardiaca nel 30% dei pazienti, tra cui aritmie, insufficienza cardiaca e morte improvvisa 1,2. Nonostante la forte risposta immunitaria dell'ospite suscitata contro il parassita durante la fase acuta, un basso numero di parassiti persiste cronicamente per tutta la vita dell'ospite in tessuti come il cuore e il muscolo scheletrico. Diversi fattori, tra cui l'insorge....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in stretta conformità con la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento delle linee guida di accreditamento per la cura degli animali da laboratorio. Il protocollo sull'uso degli animali (controllo dell'infezione da T. cruzi nei topi-A2021 04-011-Y1-A0) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia. B6. Per il presente studio sono stati utilizzati topi C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J e C57BL/6J-....
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Risultati
I tessuti fissi CUBIC sono stati lavati con PBS per rimuovere i fissativi e quindi incubati con cocktail CUBIC-L, una soluzione tamponata di base di amminoalcoli che estraggono pigmenti e lipidi dal tessuto con conseguente decolorazione del tessuto mantenendo l'architettura tissutale. Le linee della griglia nella carta possono essere viste attraverso i tessuti che indicano un'appropriata pulizia degli organi (Figura 2A). Dopo la delipidazione, i tessuti sono stati lavati e i.......
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Discussione
L'assenza di un'ampia imaging dell'intero organo dei parassiti e della risposta immunitaria limita la comprensione della complessità delle interazioni ospite-parassita e impedisce la valutazione delle terapie per la malattia di Chagas. Il presente studio ha adottato la pipeline CUBIC per chiarire e colorare organi e tessuti intatti di topi infetti da T. cruzi.
In questo studio sono stati testati più protocolli di pulizia dei tessuti (PACT32, ECi 33, FLASH
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Etsuo Susaki per il loro prezioso aiuto e le raccomandazioni riguardanti i protocolli di pulizia dei tessuti e immunocolorazione. Inoltre, siamo grati a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core per il supporto tecnico utilizzando LSFM e imaging confocale. Ringraziamo anche tutti i membri del Tarleton Research Group per gli utili suggerimenti durante questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-metilimidazolo | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolone (Antipirina | TCI | D1876 | |
| 6 pozzetti piastre per colture cellulari | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-topo Frammento Fab | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-coniglio Frammento favoloso | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| nanocorpo anti-GFP Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J topo | Il ceppo Jackson | Laboratory #007914 | Nome comune: Ai14 , Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J topo | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Nome comune: Ai14 , Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Ioduro | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J topo | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Comune Nome: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Salviette per la pulizia Kimwipes | Microscopio | T8788 | |
| Zeiss | LSM 790 | ||
| CUBIC-HV 1 kit di immunocolorazione 3D | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 kit di colorazione nucleare 3D | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Supercolla gel a base di cianoacrilato | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1'-diottadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina ioduro) Azienda: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Provette da centrifuga 15 mL | Corning | ||
| Falcon Provette da centrifuga 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalina | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Eparina | ThermoFisher Scientific | J16920. BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 o #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Software Imaris | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Ago per iniezione endovenosa 23-G | Sartori, Minisart Filtro per siringa | 16534 | |
| Kimwipes | salviette prive di lanugine Microscopio | ||
| foglio luminoso | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II sistema | |
| Metanolo | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Puntali per micropipette, 10 &; L, 200 & micro; L e 1.000 µ L | Axygen | T-300, T-200-Y e T-1000-B | |
| Pipettatore motorizzato | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Soluzione di montaggio | TCI | M3294 | |
| N-butildietanolammina | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-metilnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Forbici | Strumenti per la scienza fine | 91460-11 | |
| Pipette sierologiche | Costar Sterile | 4488 | |
| Incubatore con agitazione | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodio azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Carbonato di sodio (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Carbonato acido di sodio (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Macchia di acido nucleico verde | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Riferimenti
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
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Ristampe e permessi
