Konstruerte klaffer krever et innebygd funksjonelt vaskulært nettverk. I denne protokollen presenterer vi en metode for å fremstille en 3D-trykt vevsklaff som inneholder et hierarkisk vaskulært nettverk og dets direkte mikrokirurgiske anastomoser til rotte femoral arterie.
Engineering implanterbare, funksjonelle, tykke vev krever å designe et hierarkisk vaskulært nettverk. 3D bioprinting er en teknologi som brukes til å skape vev ved å legge lag på lag av utskrivbare biomaterialer, betegnet bioinks og celler på en ryddig og automatisk måte, noe som gjør det mulig å skape svært intrikate strukturer som tradisjonelle vevsteknikker ikke kan oppnå. Dermed er 3D bioprinting en tiltalende in vitro tilnærming for å etterligne den innfødte vaskulaturkompleksstrukturen, alt fra millimetriske kar til mikrovaskulære nettverk.
Fremskritt innen 3D-bioprinting i granulære hydrogeler gjorde det mulig med høyoppløselig ekstrudering av ekstracellulære bioinks med lav viskositet. Dette arbeidet presenterer en kombinert 3D bioprinting og offer mold-basert 3D-utskrift tilnærming for fabrikasjon konstruerte vaskulære vev klaffer. 3D bioprinting av endotel- og støtteceller ved hjelp av rekombinant kollagen-metakrylat bioink i et gelatinstøttebad brukes til fremstilling av et selvmontert kapillærnettverk. Denne trykte mikrovaskulaturen er montert rundt et mesoskala karlignende porøst stillas, fremstilt ved hjelp av en offer 3D-trykt form, og er frøet med endotelceller.
Denne samlingen induserer endotelet til mesoskalafartøyet til anastomose med det omkringliggende kapillære nettverket, og etablerer et hierarkisk vaskulært nettverk i en konstruert vevsklaff. Den konstruerte klaffen implanteres deretter direkte ved kirurgisk anastomose til en rotte femoral arterie ved hjelp av en mansjettteknikk. De beskrevne metodene kan utvides for fabrikasjon av ulike vaskulære vevsklaffer for bruk i rekonstruksjonskirurgi og vaskulariseringsstudier.
Alvorlige vevsfeil er forårsaket av traumatiske skader, medfødte defekter eller sykdom, og den nåværende gullstandarden for behandling av disse feilene er ved å bruke autologe transplantater, vaskulære vevsklaffer og mikrovaskulære frie klaffer som vevserstatninger. Imidlertid har disse alternativene ulempene med begrenset donorvev og donorstedsmorbiditet1. Dermed er det en økende etterspørsel etter alternative vevserstatninger som kan brukes til å korrigere disse feilene2. Tykkelsen på de konstruerte vevskonstruksjonene er begrenset av diffusjon av næringsstoffer og gasser mot cellene, og derfor er et riktig vaskulært nettverk avgjørende for å generere store, tykke og riktig nærede stillaser.
Flere tilnærminger har blitt brukt for å fremme vaskulærisering av konstruerte implantater3, inkludert in vivo-rekruttering av vaskulær støtte fra verten, levering av vekstfaktorer og cytokiner i stillasene, prevaskularisering av implantater, generering av en perfusabel forgreningsmikroveselen seng ved hjelp av mikropatterningsteknikker4, bruk av offermaterialer for vaskulær kanal / nettverksdannelse5 , samt opprettelse av kanaler innenfor 3D bioprinted konstruksjoner 5,6. Vaskulærisering av tykt vev krever inkorporering av et hierarkisk vaskulært nettverk som består av makroskala og mikrokapillære kar. De makroskala karene distribuerer blod effektivt gjennom hele konstruksjonen og tillater mikrokirurgiske anastomoser med vertsblodkarene, mens mikrokapillære kar gir mulighet for næringsdiffusjon.
Bioprinting har fått sterk oppmerksomhet de siste årene på grunn av fordelene det tilbyr over konvensjonelle vevsteknikksmetoder. Vev og organer er komplekse og intrikate 3D-objekter med en bestemt arkitektur. 3D-bioprinting, med sin evne til å deponere lag av biomaterialer i høy oppløsning, muliggjør evnen til å skape komplekse vevs- og organerstatninger (f.eks. nyre, lunge, lever)7. Flere utskriftsteknologier er tilpasset bioprinting, inkludert ekstruderingsbasert,blekkskriver 8, laserassistert avsetning 9,10 og stereolitografibasert11,12 bioprinting. Den ekstruderingsbaserte teknologien er avhengig av å ekstrudere materialet gjennom en dyse ved å legge trykk på material bulkoverflaten motsatt dysen.
Friform reversibel innebygging av suspenderte hydrogeler (FRESH) er en bioprinting teknikk13,14 som bruker et granulært støttemateriale der det ekstruderte materialet deponeres og festes på plass av støttebadet. Støttebadet gir mekanisk støtte for den ekstruderte, forhåndskryssede bioinken til krysskoblingen. Den største fordelen med denne teknikken er at støttebadet gjør det mulig å ekstrudere materialer med lav viskositet som ikke kan opprettholde formen etter ekstrudering og før krysskobling15. Dette utvider bassenget med tilgjengelige materialer som kan brukes som bioinks.
Dette papiret presenterer en protokoll for generering av en vaskulær klaff som kombinerer mikroskala og mesoskala vaskulaturer. For å oppnå dette genereres bioprintede, selvmontering, mikrovaskulære nettverk i rekombinant human kollagenmetakrylat (rhCollMA) hydrogel, som deretter kobles til interiøret i et større, implanterbart, vaskulært stillas, noe som resulterer i en fullt konstruert vevsklaff16. For å etablere rask og direkte perfusjon av konstruert vev, er det nødvendig med en direkte mikrokirurgisk anastomose for å være vert for fartøy. Det vaskulære stillaset har ikke tilstrekkelig suturretensjonsstyrke til å bli anastomosed ved hjelp av tradisjonell mikrokirurgisk karvegg suturering. Derfor beskriver vi en “mansjett”17,18,19 metode for å oppnå en anastomose med en rottes vanlige lårarterie. I denne metoden er fartøyets ender sikret med omkrets suturer, uten behov for å perforere karveggen.
Selv om den foreslåtte protokollen er utarbeidet for å studere hierarkisk vaskulatur i rhCollMA-miljøet, kan denne tilnærmingen utvides og brukes på en rekke nye applikasjoner. Protokollen kan brukes på bioprinting av ulike vevsspesifikke celler i forskjellige bioinks. Videre kan geometrien og størrelsen på konstruksjonene enkelt endres for å passe til spesifikke krav, for eksempel stor vevsrekonstruksjon eller biologiske studier.
Ingeniørvaskulært vev er en av hovedutfordringene ved vevsteknikk20. Nåværende metoder for å skape konstruert vaskulært vev fokuserer på å skape selvmontert mikrovaskulatur 21,22,23 eller fremstille mesoscale vaskulære stillaser24,25 og ikke på å gjenskape et system av hierarkisk vaskulatur, som kan perfused umiddelbart og direkte ved implantasjon26 . I dette arbeidet beskriver vi en protokoll som benytter to 3D-printing modaliteter for å fremstille et hierarkisk fartøynettverk sammensatt av mikroskala og mesoskala vaskulaturer. Protokollen kombinerer et 3D bioprinted, selvmontert mikrovaskulært nettverk med et mesoskala vaskulært stillas, og oppnår en implanterbar, vaskulær klaff. Videre presenterer dette papiret en protokoll for direkte anastomosing denne klaffen til en rottes lårarterie.
3D bioprinting har fått interesse de siste årene på grunn av sin allsidighet over tradisjonelle vevsteknikker. Mens denne protokollen beskriver genereringen av et mikrovaskulært nettverk i rhCollMA bioink, kan metodene som brukes brukes brukes med få modifikasjoner på mange andre bioinks fra mengden studert og nye bioinks og støtte bad27,28. Vi valgte å bruke rhCollMA som bioink på grunn av overflod av type I kollagen i den menneskelige ECM, noe som gir et passende miljø for cellevedlegg. Videre produseres det rekombinant i planter og videre modifisert med metakrylatgrupper, noe som muliggjør fotopolymerisering og dannelse av stabile 3D-hydrogeler29,30. Photocrosslinking ble oppnådd ved tilsetning av fotoinitiatoren LAP, som har vist seg å være giftfri og aktiveres ved eksponering for 405 nm blått lys, noe som reduserer mulig fototoksisitet av UV-lys. Imidlertid krever bruk av lysfølsomme bioinks bruk av et fenol rødfritt kulturmedium for fremstilling av bioink og støttematerialet. Videre beskriver protokollen bruken av gelatinstøttemateriale, noe som muliggjør ekstrudering av bioinks som rhCollMA. Dermed er det viktig å sikre bruk av kaldt medium under forberedelsen og kjølingen av skriversengen. Overdreven oppvarming kan oppstå på grunn av lyskilden som brukes til krysskobling eller fra forhøyede omgivelsestemperaturer.
En ekstruderingsbasert bioprinter har blitt brukt her for å skape det biotrykte mikrovaskulære nettverket, og det er for tiden mange kommersielt tilgjengelige bioprintere som kan generere lignende konstruksjoner. Videre kan de foreslåtte metodene enkelt endres og brukes til å studere forskjellige geometrier, størrelser og fyllingsmønstre. I dette arbeidet ble et rettlinjet fyllingsmønster valgt for å skape sammenkoblede porer, og dette kan skrives ut relativt raskt med høy kvalitet.
Luftbobler introduserer en betydelig utfordring i ekstruderingsbioprinting, spesielt inne i støttematerialer. Derfor er det avgjørende å minimere tilstedeværelsen og dannelsen av disse boblene ved å bruke positive forskyvningspipetter for overføring av støttematerialet, utarbeidelsen av bioink-cellefjæringen og overføringen til utskriftspatronene.
I dette arbeidet ble humane fettavledede endotelceller og tannmasse stamceller brukt som støtteceller på grunn av deres relativt enkle isolasjon fra pasienter. Videre ble en total cellekonsentrasjon på 8 x 106 celler / ml valgt siden denne konsentrasjonen har vist seg å etablere de mest utviklede vaskulære nettverkene16. Selv om denne protokollen kan brukes til å generere mikrovaskulatur ved hjelp av forskjellige celletyper og kilder, samt forskjellige bioinks, må det gjøres en kalibrering av cellekonsentrasjon for å etablere de beste forholdene for utviklingen av det mikrovaskulære nettverket. Videre kan vevsspesifikke celler (dvs. myoblaster eller osteoblaster) innlemmes i bioink for å oppnå vevsspesifikke vaskulære klaffer.
Formen til det porøse vaskulære stillaset ble fremstilt ved hjelp av 3D-trykt vannløselig materiale på en kommersielt tilgjengelig ekstruderings 3D-skriver. Dette resulterer i en kostnadseffektiv teknikk basert på raske prototypingsplattformer, slik at mange forskjellige geometrier og størrelser av vaskulære stillaser kan studeres og screenes raskt31. Likevel er en begrensning av denne metoden oppløsningsgrensen for de fleste 3D-skrivere32. Men med den raskt utviklende industrien rundt additiv tilvirkning, forventes disse grensene å forbedre seg over tid. Bruken av organiske løsningsmidler for fabrikasjonsprosessen er en annen begrensning i protokollen, da de fleste organiske løsningsmidler er giftige for celler, og forhindrer evnen til å kombinere bioprintprosedyren med den vaskulære stillasfabrikasjonsprosessen.
Den beskrevne metoden for såing av lumen av stillaset ved hjelp av aspirasjon i motsetning til å skyve celleopphenget har store effekter på lokaliseringen av frøcellene. Bruk av negativt trykk gjør det mulig å endotelisere stillasets indre lumen samtidig som det minimerer søl av cellefjæringen gjennom perforeringene på stillasets vegg16.
Den beskrevne “mansjett” metoden for mikrokirurgiske anastomoser kan enkelt modifiseres og tilpasses forskjellige vaskulære stillasmaterialer eller størrelser, samt til forskjellige arterier og årer i en bred skala av dyremodeller. Tilpasningene til protokollen vil omfatte forskjellige polyimidrørstørrelser og suturstørrelser. Denne metoden krever ikke perforering av stillasveggen, noe som kan føre til utvikling av feil. Dette arbeidet presenterer en protokoll som kan utvides til mange programmer. De kritiske aspektene ved denne protokollen, som inkluderer fabrikasjon av meso- og mikroskala vaskulatur og deres montering og implantasjon, representerer kritiske aspekter ved konstruerte klaffer både for rekonstruktive applikasjoner, samt vaskulære og andre vevsteknikkstudier.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet fikk støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale nr. 818808). rhCollMA ble sjenerøst levert av CollPlant (Rehovot, Israel). Forfatterne takker Technions prekliniske forskningsmyndighet for hjelpen med dyrepleie, samt Janette Zavin, Galia Ben David og Idan Redenski.
1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
Acland clamps | S&T | B-1V | |
Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
Duratears | Alcon | DJ03 | |
ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | – | |
Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
NEAA | Gibco | 11140068 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
Scalpel handle – #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |