Konstruerade klaffar kräver ett integrerat funktionellt vaskulärt nätverk. I detta protokoll presenterar vi en metod för att tillverka en 3D-tryckt vävnadsflik innehållande ett hierarkiskt vaskulärt nätverk och dess direkta mikrokirurgiska anastomoser till råtta lårbensartär.
Ingenjörs implanterbara, funktionella, tjocka vävnader kräver att man utformar ett hierarkiskt vaskulärt nätverk. 3D-bioprintning är en teknik som används för att skapa vävnader genom att lägga till lager på lager av utskrivbara biomaterial, så kallade biobläck och celler på ett ordnat och automatiskt sätt, vilket gör det möjligt att skapa mycket invecklade strukturer som traditionella vävnadstekniktekniker inte kan uppnå. Således är 3D-bioprintning ett tilltalande in vitro-tillvägagångssätt för att efterlikna den ursprungliga vaskulära komplexa strukturen, allt från millimetriska kärl till mikrovaskulära nätverk.
Framsteg inom 3D-bioprintning i granulära hydrogeler möjliggjorde högupplöst extrudering av extracellulära matrisbaserade biobläck med låg viskositet. Detta arbete presenterar en kombinerad 3D-bioprintning och offerformbaserad 3D-utskriftsmetod för tillverkning av konstruerade vaskulära vävnadsflikar. 3D-bioprintning av endotel- och stödceller med användning av rekombinant kollagen-metakrylatbiobläck i ett gelatinstödbad används för tillverkning av ett självmonterat kapillärnätverk. Denna tryckta mikrovaskulatur är monterad runt en mesoskala kärlliknande porös ställning, tillverkad med hjälp av en offer 3D-tryckt form och är sådd med endotelceller.
Denna enhet inducerar endotelet i mesoskalakärlet till anastomos med det omgivande kapillärnätet, vilket etablerar ett hierarkiskt vaskulärt nätverk inom en konstruerad vävnadsflik. Den konstruerade klaffen implanteras sedan direkt av kirurgisk anastomos till en råtta lårbensartär med hjälp av en manschettteknik. De beskrivna metoderna kan utökas för tillverkning av olika vaskulära vävnadsflikar för användning vid rekonstruktionskirurgi och vaskulariseringsstudier.
Allvarliga vävnadsdefekter orsakas av traumatiska skador, medfödda defekter eller sjukdom, och den nuvarande guldstandarden för behandling av dessa defekter är att använda autologa transplantat, vaskulära vävnadsflikar och mikrovaskulära fria klaffar som vävnadssubstitut. Dessa alternativ har emellertid nackdelarna med begränsad vävnad på donatorstället och morbiditet på donatorstället1. Således finns det en växande efterfrågan på alternativa vävnadssubstitut som kan användas för att korrigera dessa defekter2. Tjockleken på de konstruerade vävnadskonstruktionerna begränsas av diffusionen av näringsämnen och gaser mot cellerna, och därför är ett ordentligt vaskulärt nätverk viktigt för att generera stora, tjocka och ordentligt närda byggnadsställningar.
Flera tillvägagångssätt har tillämpats för att främja vaskularisering av konstruerade implantat3, inklusive in vivo rekrytering av vaskulärt stöd från värden, leverans av tillväxtfaktorer och cytokiner i byggnadsställningarna, prevaskularisering av implantat, generering av en perfanvändbar förgreningsmikrovesselbädd med hjälp av mikropatterningstekniker4, användning av offermaterial för vaskulär kanal / nätverksbildning5 , samt skapandet av kanaler inom 3D-bioprintade konstruktioner 5,6. Vaskularisering av tjocka vävnader kräver införlivande av ett hierarkiskt vaskulärt nätverk bestående av makroskala och mikrokapillärskala kärl. De makroskaliga kärlen fördelar blod effektivt genom hela konstruktionen och möjliggör mikrokirurgiska anastomoser med värdblodkärlen, medan kärlen i mikrokapillär skala möjliggör näringsdiffusion.
Bioprinting har fått stor uppmärksamhet de senaste åren på grund av de fördelar det erbjuder jämfört med konventionella vävnadstekniska metoder. Vävnader och organ är komplexa och invecklade 3D-objekt med en specifik arkitektur. 3D-bioprintning, med dess förmåga att deponera lager av biomaterial i hög upplösning, möjliggör förmågan att skapa komplexa vävnads- och organsubstitut (t.ex. njure, lunga, lever)7. Flera trycktekniker har anpassats för bioprintning, inklusive extruderingsbaserad,bläckstråleskrivare 8, laserassisterad deposition 9,10 och stereolitografibaserad11,12 bioprinting. De extruderingsbaserade teknikerna är beroende av extrudering av materialet genom ett munstycke genom att applicera tryck på materialets bulkyta mittemot munstycket.
Friforms reversibel inbäddning av suspenderade hydrogeler (FRESH) är en bioprintningsteknik13,14 som använder ett granulärt stödmaterial där det extruderade materialet deponeras och fixeras på plats av stödbadet. Stödbadet ger mekaniskt stöd för det extruderade, förkorsade biobläcket tills dess tvärbindning. Den största fördelen med denna teknik är att stödbadet möjliggör extrudering av material med låg viskositet som inte kan behålla sin form efter extrudering och före tvärbindning15. Detta utökar poolen av tillgängliga material som kan användas som biobläck.
Detta papper presenterar ett protokoll för generering av en vaskulär flik som kombinerar mikroskala och mesoskala vaskulatures. För att uppnå detta genereras bioprintade, självmonterande, mikrovaskulära nätverk i rekombinant humant kollagenmetakrylat (rhCollMA) hydrogel, som sedan ansluts till det inre av en större, implanterbar, vaskulär byggnadsställning, vilket resulterar i en helt konstruerad vävnadsflik16. För att upprätta snabb och direkt perfusion av konstruerade vävnader krävs en direkt mikrokirurgisk anastomos till värdkärl. Kärlställningen har inte tillräcklig suturhållningsstyrka för att anastomoseras med traditionell mikrokirurgisk kärlväggssuturering. Därför beskriver vi en “manschett”17,18,19 metod för att uppnå en anastomos med en råttas gemensamma lårbensartär. I denna metod är kärländarna säkrade med omkretssuturer utan att behöva perforera kärlväggen.
Även om det föreslagna protokollet har utarbetats för att studera hierarkisk vaskulatur i rhCollMA-miljön, kan detta tillvägagångssätt utökas och tillämpas på en mängd nya applikationer. Protokollet kan tillämpas på bioprintning av olika vävnadsspecifika celler i olika biobläck. Dessutom kan konstruktionens geometri och storlek enkelt modifieras för att passa specifika krav, såsom rekonstruktion av stora vävnader eller biologiska studier.
Att konstruera vaskulära vävnader är en av de största utmaningarna inom vävnadsteknik20. Nuvarande metoder för att skapa konstruerad kärlvävnad fokuserar på att skapa självmonterad mikrovaskulatur 21,22,23 eller tillverka mesoskala vaskulära byggnadsställningar 24,25 och inte på att återskapa ett system av hierarkisk vaskulatur, som kan perfuseras omedelbart och direkt vid implantation26 . I detta arbete beskriver vi ett protokoll som använder två 3D-utskriftsmetoder för att tillverka ett hierarkiskt kärlnätverk bestående av mikroskala och mesoskala vaskulatur. Protokollet kombinerar ett 3D-bioprintat, självmonterat mikrovaskulärt nätverk med en vaskulär byggnadsställning i mesoskala, vilket ger en implanterbar, vaskulär flik. Dessutom presenterar detta papper ett protokoll för att direkt anastomosera denna flik till en råttas lårbensartär.
3D-bioprintning har fått intresse de senaste åren på grund av dess mångsidighet jämfört med traditionella vävnadstekniktekniker. Medan detta protokoll beskriver genereringen av ett mikrovaskulärt nätverk i rhCollMA biobläck, kan de använda metoderna tillämpas med få modifieringar på många andra biobläck från överflödet av studerade och nya biobläck och stödbad27,28. Vi valde att använda rhCollMA som ett biobläck på grund av överflödet av kollagen av typ I i den mänskliga ECM, vilket ger en lämplig miljö för cellfästning. Dessutom produceras den rekombinant i växter och modifieras ytterligare med metakrylatgrupper, vilket möjliggör fotopolymerisation och bildning av stabila 3D-hydrogeler29,30. Fotokrysslänkning uppnåddes genom tillägg av fotoinitiatorn LAP, som har visat sig vara giftfri och aktiveras genom exponering för 405 nm blått ljus, vilket minskar UV-ljusets möjliga fototoxicitet. Användningen av ljuskänsliga biobläck kräver emellertid användning av ett fenolrött fritt odlingsmedium för framställning av biobläcket och stödmaterialet. Dessutom beskriver protokollet användningen av gelatinstödmaterial, vilket möjliggör högkvalitativ extrudering av biobläck som rhCollMA. Således är det viktigt att säkerställa användningen av kallt medium under beredningen och kylningen av skrivarbädden. Överdriven uppvärmning kan uppstå på grund av ljuskällan som används för tvärbindning eller från förhöjda omgivningstemperaturer.
En extruderingsbaserad bioprinter har använts här för att skapa det bioprintade mikrovaskulära nätverket, och det finns för närvarande många kommersiellt tillgängliga bioprinters som kan generera liknande konstruktioner. Dessutom kan de föreslagna metoderna enkelt modifieras och tillämpas för att studera olika geometrier, storlekar och fyllnadsmönster. I detta arbete valdes ett rätlinjigt utfyllnadsmönster för att skapa sammankopplade porer, och detta kan skrivas ut relativt snabbt med hög trohet.
Luftbubblor utgör en betydande utmaning vid extrudering av bioprinting, särskilt inuti stödmaterial. Därför är det avgörande att minimera närvaron och bildandet av dessa bubblor genom att använda positiva förskjutningspipetter för överföring av stödmaterialet, framställning av biobläckcellsuspensionen och deras överföring till tryckpatronerna.
I detta arbete användes humana fett-härledda endotelceller och tandmassastamceller som stödjande celler på grund av deras relativt enkla isolering från patienter. Dessutom valdes en total cellkoncentration på 8 x 106 celler / ml eftersom denna koncentration har visat sig etablera de mest utvecklade vaskulära nätverken16. Även om detta protokoll kan användas för att generera mikrovaskulatur med hjälp av olika celltyper och källor, liksom olika biobläck, måste en kalibrering av cellkoncentrationen göras för att skapa de bästa förutsättningarna för utvecklingen av det mikrovaskulära nätverket. Dessutom kan vävnadsspecifika celler (dvs. myoblaster eller osteoblaster) införlivas i biobläcket för att uppnå vävnadsspecifika vaskulära flikar.
Formen för den porösa kärlställningen tillverkades med 3D-tryckt vattenlösligt material på en kommersiellt tillgänglig extruderings 3D-skrivare. Detta resulterar i en kostnadseffektiv teknik baserad på snabba prototypplattformar, så att många olika geometrier och storlekar på kärlställningar kan studeras och screenas snabbt31. Ändå är en begränsning av denna metod upplösningsgränsen för de flesta 3D-skrivare32. Men med den snabbt utvecklande industrin kring additiv tillverkning förväntas dessa gränser förbättras med tiden. Användningen av organiska lösningsmedel för tillverkningsprocessen är en annan begränsning av protokollet, eftersom de flesta organiska lösningsmedel är giftiga för celler, vilket förhindrar förmågan att kombinera bioprintningsproceduren med tillverkningsprocessen för kärlställningar.
Den beskrivna metoden att så ställningens lumen med hjälp av aspiration i motsats till att trycka på cellsuspensionen har stora effekter på lokaliseringen av de sådda cellerna. Användning av undertryck möjliggör endotelisering av ställningens inre lumen samtidigt som eventuellt spill av cellsuspensionen minimeras genom perforeringarna på ställningens vägg16.
Den beskrivna “manschett” -metoden för mikrokirurgiska anastomoser kan enkelt modifieras och anpassas till olika vaskulära byggnadsställningar eller storlekar, liksom till olika artärer och vener i en stor skala av djurmodeller. Anpassningarna av protokollet skulle inkludera olika polyimidrörstorlekar och suturstorlekar. Denna metod kräver inte perforering av ställningsväggen, vilket kan leda till utveckling av defekter. Detta arbete presenterar ett protokoll som kan utökas till många applikationer. De kritiska aspekterna av detta protokoll, som inkluderar tillverkning av meso- och mikroskala vaskulatur och deras montering och implantation, representerar kritiska aspekter av konstruerade klaffar både för rekonstruktiva applikationer, såväl som vaskulära och andra vävnadstekniska studier.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt fick finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 818808). rhCollMA tillhandahölls generöst av CollPlant (Rehovot, Israel). Författarna tackar Technions prekliniska forskningsmyndighet för hjälpen med djurvård, liksom Janette Zavin, Galia Ben David och Idan Redenski.
1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
Acland clamps | S&T | B-1V | |
Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
Duratears | Alcon | DJ03 | |
ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | – | |
Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
NEAA | Gibco | 11140068 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
Scalpel handle – #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |