돼지 심장에서 용량 성 면역 프로브에 의한 신경 펩티드 역학의 시간 해결 생체 내 측정
Summary
생체 내에서 펩티드 전달체를 측정하기 위해 확립된 면역화학적 방법은 오프라인 분석을 위한 샘플을 얻기 위해 미세투석 또는 벌크 유체 드로우에 의존한다. 그러나 이들은 시공간 적 한계로 고통 받고 있습니다. 본 프로토콜은 기존 기술의 한계를 극복하는 용량성 면역프로브 바이오센서의 제조 및 적용을 기술한다.
Abstract
질병 진행의 평가와 관련된 생체내 바이오마커를 측정하는 능력은 과학 및 의학계에 큰 관심사이다. 특정 바이오마커를 측정하는 현재의 방법으로부터 수득된 결과의 분해능은 공간적 및 시간적 분해능에서 제한될 수 있기 때문에 수득하는데 수일 또는 수주가 걸릴 수 있다(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석법[ELISA], 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC], 또는 질량 분광법에 의해 분석된 간질성 유체의 유체 구획 미세투석); 따라서시기 적절한 진단과 치료에 대한 지침이 중단됩니다. 본 연구에서는, 용량성 면역프로브 바이오센서(CI probe)의 사용을 통해 생체내에서 펩티드 전달물질을 검출 및 측정하기 위한 독특한 기술이 보고되었다. 이들 프로브의 제조 프로토콜 및 시험관내 특성화가 기재되어 있다. 생체내에서 교감신경자극-유발된 신경펩티드 Y(NPY) 방출의 측정이 제공된다. NPY 방출은 참고로 노르에피네프린의 교감신경 방출과 상관관계가 있다. 이 데이터는 생체 내에서 신경 펩티드의 빠르고 국소화된 측정을 위한 접근법을 입증한다. 향후 적용에는 질병 진행에 대한 수술 내 실시간 평가 및 이러한 프로브의 최소 침습적 카테터 기반 배치가 포함됩니다.
Introduction
바이오마커를 검출하고 정량화하기 위한 몇 가지 화학적 방법은 단백질 화학 및 임상 진단, 특히 암 진단 및 심혈관 질환 진행 평가에서 일상적으로 활용됩니다. 현재, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 및 질량 분광법과 같은 방법은 미세투석에 의한 벌크 유체 드로 또는 간질성 구획에 의한 혈관 구획 1,2,3으로부터의 샘플 수집에 의존한다. 미세투석은 관심 영역에 배치되는 공지된 길이의 반투과성 막 튜브를 사용한다. 수집 유체는 분석(5)을 위해 샘플을 수집하기 위해 수 분에 걸쳐 튜브(4)를 통해 관류되고, 따라서 시간적 분해능을 제한한다. 이러한 방식으로, 수집된 샘플은 국소 미세환경의 시간에 따른 평균화된 값만을 제공하고, 충분한 샘플 부피의 관류 속도 및 수집에 의해 제한된다. 또한, 이러한 방법은 실험 데이터 및 신호 평균화의 풀링을 필요로합니다. 따라서 피험자 간의 변동성을 설명하지 못할 수 있습니다. 중요한 것은 샘플 수집과 후속 오프라인 분석 사이의 시간이 즉각적인 임상 개입 및 치료제를 배제한다는 것입니다.
본 프로토콜에서, 특정 생체활성 펩티드의 시간-해결 전기적 검출을 위한 용량성 면역프로브 바이오센서(CI probe)의 사용이 개략적으로 설명된다. 혈관조직, 심내막, 심근세포 및 심장 내 신경절을 신경질하는 신경절 후 교감신경 신경세포로부터 방출되는 뉴로펩티드 Y(NPY)는 심혈관 계 6,7,8,9의 주요 신경조절 펩티드 전달물질이다. 여기에 제시된 방법은 NPY를 측정하기 위해 설계되었으며 실험 타당성은 돼지 심장 모델에서 입증됩니다. 그러나, 이러한 접근법은 선택적 항체가 이용가능한 임의의 생체활성 펩티드(10)에 적용된다. 이 방법은 기능화된 팁(11,12)에서 백금 와이어 프로브와 전도성 유체 사이의 용량성 접합부에 의존한다. 본 출원에서, 상호작용은 표적 뉴로펩티드 (NPY)에 대한 항체를 통해 매개되었고, 이는 전극 팁에 결합되었고, 전도성 유체 환경을 인터페이싱하였다. 이러한 기능화는 백금 와이어 프로브(10,13)의 팁 상으로의 반응성 폴리도파민의 전착을 통해 달성되었다.
항체-기능화된 프로브가 생체내에서 관심 영역에 배치될 때, 유발된 내인성 NPY 방출은 프로브 팁 상의 포획 항체에 대한 결합을 유도하고, 전극 표면에서의 전도성 유체는 NPY 단백질에 의해 변위된다. 전기 환경의 국부적 변화는 움직이지 않고 정적으로 하전된 분자를 가진 높은 이동성, 고 유전체 유체의 변위를 초래합니다. 이것은 전극-유체 계면을 변경하고, 따라서 그의 커패시턴스를 변화시키고, 이는 단계-함수 명령 전위에 응답하는 전하 전류의 변화로서 측정된다. 음성 “리셋” 전위는 정전기적 상호작용을 통해 항체로부터 결합된 NPY를 격퇴하기 위해 각각의 개별 측정 사이클 직후에 사용되고, 따라서 측정10의 후속 라운드를 위해 항체 결합 부위를 클리어링한다. 이를 통해 시간 해결 방식으로 NPY를 효과적으로 측정 할 수 있습니다. 독특한 CI 기술은 위에서 설명한 미세투석 기반 면역화학적 방법의 한계를 극복하여 여러 실험9에 걸쳐 데이터 풀링 또는 신호 평균화 없이 단일 실험에서 동적 바이오마커 수준을 측정하여 거의 실시간으로 데이터를 제공합니다. 더욱이, 이 방법을 시간-해결 및 국부적 규모로 적절한 항체가 존재하는 관심있는 임의의 바이오마커에 적응시키는 능력은 질환 진행의 평가 및 치료적 개입의 안내를 위한 면역화학적 측정에서 주요한 기술적 진보를 제공한다.
데이터 수집 및 분석용 소프트웨어는 IGOR Pro(완전 대화형 소프트웨어 환경)로 사용자 정의되어 작성되었습니다. 아날로그-디지털 컨버터(A/D) 시스템은 컴퓨터 제어 하에 명령 전압을 발생시키고 사용자 증폭기에서 데이터를 수집했습니다. 앰프는 특정 고유 한 기능을 가지고있었습니다. 여기에는 네 개의 수집 채널 각각에 대한 피드백 저항기(전환 가능)가 포함되어 있어 전극의 가변성을 통합하기 위해 1MOhm 또는 10MOhm 피드백 전압 클램프 회로를 선택할 수 있습니다. 네 개의 수집 채널 모두에 대해 단일 헤드와 상호 접지/기준 회로가 있는 스테이지 유닛도 단일 물리적 모듈에서 가슴 가까이에 장치를 배치하도록 제작되었습니다. 1 MOhm 피드백 저항기 설정을 사용하여 보고된 모든 데이터를 수집했습니다.
필터 및 이득 설정은 증폭기에서 전신되어 데이터 파일 내에 기록되었습니다. 데이터는 10kHz에서 디지털화된 2극 아날로그 베셀 필터를 통해 1kHz에서 필터링되었습니다. 프로브와 주변 전도성 용액 사이의 전위 차이는 프로브 팁에 헬름홀츠 정전 용량 층을 생성합니다. 프로브 팁에서 항체에 대한 리간드 결합은 변경된 국소 전하를 초래하고, 따라서, 헬름홀츠 커패시턴스의 변화를 초래한다. 회로의 정전 용량 구성 요소의 이러한 변화는 프로브를 스텝 기능 전압 프로토콜의 전위로 가져 오는 데 필요한 주입 된 전하의 크기의 변화를 초래합니다. 따라서, 기능화된 프로브에 대한 특정 리간드의 결합은 피크 용량성 전류의 변화로서 전극 커패시턴스 측정의 변화를 초래한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 시험관 내 및 생체내 설정 둘 다에서 관심있는 바이오마커를 검출 및 측정할 수 있는 용량성 면역프로브(CI probe)의 제조 및 시험을 기술한다. 검출은 바이오마커를 전극 팁에 포획함으로써 달성된다. 트래핑 이벤트는 백금 와이어 정전 용량 면역 프로브와 주변 전도성 유체 환경 사이의 용량성 접합을 변경하며, 프로브의 잠재적 이동에 대한 응답으로 전하 전류의 변화…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
생체 내 실험에 대한 전문가의 지원을 해주신 Olu Ajijola 박사(UCLA Cardiac Arrhythmia Center)에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH U01 EB025138 (JLA, CS)에서 지원했습니다.
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
Riferimenti
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S. Adrenal responses to stress. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Prodromidis, M. I. Impedimetric immunosensors-A review. Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
