Tidsopløst In Vivo-måling af neuropeptiddynamik ved kapacitiv immunoprobe i svinehjerte

Summary

Etablerede immunokemiske metoder til måling af peptidtransmittere in vivo er afhængige af mikrodialyse eller bulkvæskeudtrækning for at opnå prøven til offline analyse. Disse lider dog af spatiotemporale begrænsninger. Den nuværende protokol beskriver fremstilling og anvendelse af en kapacitiv immunoprobe biosensor, der overvinder begrænsningerne i de eksisterende teknikker.

Abstract

Evnen til at måle biomarkører in vivo , der er relevante for vurderingen af sygdomsprogression, er af stor interesse for de videnskabelige og medicinske samfund. Opløsningen af resultater opnået fra nuværende metoder til måling af visse biomarkører kan tage flere dage eller uger at opnå, da de kan være begrænset i opløsning både rumligt og tidsmæssigt (f.eks. Væskerumsmikrodialyse af interstitiel væske analyseret ved enzymbundet immunosorbentassay [ELISA], højtydende væskekromatografi [HPLC] eller massespektrometri); således forstyrres deres vejledning om rettidig diagnose og behandling. I denne undersøgelse rapporteres en unik teknik til påvisning og måling af peptidtransmittere in vivo ved anvendelse af en kapacitiv immunoprobe biosensor (CI-sonde). Fremstillingsprotokollen og in vitro-karakteriseringen af disse sonder er beskrevet. Målinger af sympatisk stimulering-fremkaldt neuropeptid Y (NPY) frigivelse in vivo er tilvejebragt. NPY-frigivelse er korreleret med den sympatiske frigivelse af noradrenalin til reference. Dataene viser en tilgang til hurtig og lokaliseret måling af neuropeptider in vivo. Fremtidige anvendelser omfatter intraoperativ realtidsvurdering af sygdomsprogression og minimalt invasiv kateterbaseret implementering af disse sonder.

Introduction

Flere kemiske metoder til påvisning og kvantificering af biomarkører anvendes rutinemæssigt i både proteinkemi og klinisk diagnostik, især i kræftdiagnoser og vurdering af hjerte-kar-sygdomsprogression. I øjeblikket er metoder såsom højtydende væskekromatografi (HPLC), enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og massespektrometri afhængige af prøveindsamling fra vaskulærrummet ^1,2,3 ved bulkvæskeudtrækning eller det interstitielle rum ved mikrodialyse. Mikrodialyse anvender et semipermeabelt membranrør af kendt længde, der er placeret i et område af interesse. Opsamlingsvæske perfunderes gennem røret over flere minutter⁴ for at indsamle prøven til analyse⁵, hvilket begrænser den tidsmæssige opløsning. På denne måde giver de indsamlede prøver kun en gennemsnitlig værdi over tid af det lokale mikromiljø og er begrænset af perfusionshastigheden og indsamlingen af tilstrækkelig prøvevolumen. Desuden kræver disse metoder pooling af eksperimentelle data og signalgennemsnit; derfor kan de undlade at tage højde for variabilitet mellem emner. Det er vigtigt, at tiden mellem prøveindsamling og efterfølgende offline analyse udelukker øjeblikkelig klinisk intervention og terapi.

I den nuværende protokol er brugen af en kapacitiv immunoprobe biosensor (CI-sonde) til den tidsopløste elektriske detektion af specifikke bioaktive peptider skitseret. Neuropeptid Y (NPY), frigivet fra post-ganglione sympatiske neuroner, der innerverer vaskulaturen, endokardiet, kardiomyocytter og intrakardiale ganglier, er en vigtig neuromodulerende peptidsender i det kardiovaskulære system 6,7,8,9. Metoden, der præsenteres her, er designet til at måle NPY, og den eksperimentelle gennemførlighed demonstreres i en svinehjertemodel. Denne fremgangsmåde gælder imidlertid for ethvert bioaktivt peptid, for hvilket et selektivt antistof er tilgængeligt¹⁰. Denne metode er afhængig af det kapacitive kryds mellem en platintrådssonde og den ledende væske ved den funktionaliserede spids^11,12. I denne applikation blev interaktionen medieret gennem et antistof mod målneuropeptidet (NPY), som var bundet til elektrodespidsen, der grænseflade det ledende væskemiljø. Denne funktionalisering blev opnået gennem elektrodeposition af reaktiv polydopamin på spidsen af platintrådssonden ^10,13.

Når den antistoffunktionaliserede sonde placeres i et område af interesse in vivo, fører fremkaldt endogen NPY-frigivelse til binding til fangstantistofferne på sondespidsen, og den ledende væske ved elektrodeoverfladen fortrænges af NPY-proteinet. Lokal ændring i det elektriske miljø resulterer i forskydning af højmobilitet, højdielektrisk væske med et immobilt, statisk ladet molekyle. Dette ændrer elektrode-væske-grænsefladen og dermed dens kapacitans, som måles som en ændring i ladningsstrøm som reaktion på et trinfunktionskommandopotentiale. Et negativt “nulstillingspotentiale” anvendes umiddelbart efter hver enkelt målecyklus til at afvise bundet NPY fra antistoffet gennem elektrostatisk interaktion og dermed rydde antistofbindingsstederne for efterfølgende runder af måling¹⁰. Dette giver effektivt mulighed for måling af NPY på en tidsbestemt måde. Den unikke CI-teknik overvinder begrænsningerne ved de mikrodialysebaserede immunokemiske metoder, der er skitseret ovenfor, til at måle dynamiske biomarkørniveauer fra et enkelt eksperiment uden datapooling eller signalgennemsnit over flere eksperimenter⁹, hvilket giver data i næsten realtid. Desuden giver evnen til at tilpasse denne metode til enhver biomarkør af interesse, for hvilken der findes et passende antistof på en tidsopløst og lokaliseret skala, et stort teknisk fremskridt inden for immunokemisk måling til evaluering af sygdomsprogression og vejledning af terapeutiske interventioner.

Softwaren til dataindsamling og analyse blev specialskrevet i IGOR Pro (et fuldt interaktivt softwaremiljø). Et analogt til digitalt konvertersystem (A / D) udstedte en kommandospænding under computerstyring og hentede data fra en brugerdefineret forstærker. Forstærkeren havde visse unikke funktioner. Disse omfattede en feedbackmodstand (omskiftelig) for hver af de fire opsamlingskanaler, hvilket giver mulighed for at vælge 1 MOhm eller 10 MOhm feedback spændingsklemme kredsløb for at integrere elektrodens variabilitet. En sceneenhed med et enkelt hoved og gensidig jord / referencekredsløb til alle de fire erhvervelseskanaler blev også bygget til at placere enheden tæt ved brystet i et enkelt fysisk modul. En 1 MOhm feedback modstand indstilling blev brugt til at indsamle alle de rapporterede data.

Filter- og forstærkningsindstillingerne blev telegraferet fra forstærkeren og optaget i datafilen. Data blev filtreret ved 1 kHz via et 2-polet analogt Bessel-filter digitaliseret ved 10 kHz. Forskellen i potentiale mellem sonden og den omgivende ledende opløsning skaber et Helmholtz kapacitivt lag ved sondespidsen. Ligandbinding til antistoffet ved sondespidsen resulterer i en ændret lokal ladning og dermed en ændring i Helmholtz-kapacitansen. Denne ændring i kredsløbets kapacitive komponent resulterer i et skift i størrelsen af den injicerede ladning, der kræves for at bringe sonden til potentialet i trinfunktionsspændingsprotokollen. Bindingen af en specifik ligand til den funktionaliserede sonde resulterer således i en ændring i elektrodekapacitansmålingen som en ændring i spidskapacitiv strøm.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of California, Los Angeles Animal Research Committee og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health Guide for care and use of laboratory animals (8. udgave, 2011). Voksne Yorkshire-hansvin på ca. 75 kg blev anvendt til in vivo-undersøgelse 10. 1. Kapacitiv immunoprobe fabrikation og funktionalisering Skær en 25 cm længde perfluoralkoxy (PFA) -belagt…

Representative Results

Elektrodefabrikation og karakteriseringEn fleksibel kapacitiv immunoprobe (CI-sonder) blev fremstillet, og et repræsentativt billede er afbildet i figur 1A. Elektrodepotentialet blev indstillet af et computerstyret spændingsklemekredsløb (figur 1B), og elektroden blev nedsænket i en polydopaminopløsning fremstillet i PBS. Polydopamin blev elektrodepositeret på den ledende elektrodespids13 til funktionalisering. …

Discussion

Denne protokol beskriver fremstilling og testning af en kapacitiv immunoprobe (CI-sonde), der er i stand til at detektere og måle biomarkører af interesse i både in vitro- og in vivo-indstillinger . Detektion opnås ved at fange biomarkøren ved elektrodespidsen. Fangsthændelsen ændrer det kapacitive kryds mellem en platintrådkapacitiv immunoprobe og det omgivende ledende væskemiljø målt som en ændring i ladningsstrømmen som reaktion på et potentielt skift i sonden. En unik elektrisk erhverv…

Materials

AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654