Determinazione dell'affinità di legame (KD) degli anticorpi radiomarcati contro gli antigeni immobilizzati

Sommario

Qui, viene descritto un metodo per determinare l'affinità di legame (K_D) degli anticorpi radiomarcati agli antigeni immobilizzati. K_D è la costante di dissociazione di equilibrio che può essere determinata da un esperimento di legame di saturazione misurando il legame totale, specifico e non specifico di un anticorpo radiomarcato a varie concentrazioni al suo antigene.

Abstract

Determinare l'affinità di legame (K_D) è un aspetto importante della caratterizzazione degli anticorpi radiomarcati (rAb). Tipicamente, l'affinità di legame è rappresentata dalla costante di dissociazione di equilibrio, K_D, e può essere calcolata come la concentrazione di anticorpi alla quale metà dei siti di legame anticorpale sono occupati all'equilibrio. Questo metodo può essere generalizzato a qualsiasi anticorpo radiomarcato o ad altre scaffold proteiche e peptidiche. A differenza dei metodi basati sulle cellule, la scelta degli antigeni immobilizzati è particolarmente utile per convalidare le affinità di legame dopo la conservazione a lungo termine degli anticorpi, distinguere le affinità di legame dei bracci della regione legante l'antigene del frammento (Fab) nei costrutti anticorpali bispecifici e determinare se esiste variabilità nell'espressione dell'antigene tra diverse linee cellulari. Questo metodo prevede l'immobilizzazione di una quantità fissa di antigene in pozzetti specificati su una piastra frangibile a 96 pozzetti. Quindi, il legame non specifico è stato bloccato in tutti i pozzetti con albumina sierica bovina (BSA). Successivamente, il rAb è stato aggiunto in un gradiente di concentrazione a tutti i pozzi. È stato scelto un intervallo di concentrazioni per consentire al rAb di raggiungere la saturazione, cioè una concentrazione di anticorpi alla quale tutti gli antigeni sono continuamente legati dal rAb. Nei pozzetti designati senza antigene immobilizzato, è possibile determinare il legame non specifico del rAb. Sottraendo il legame non specifico dal legame totale nei pozzetti con antigene immobilizzato, è possibile determinare il legame specifico del rAb all'antigene. Il K_D del rAb è stato calcolato dalla curva di legame di saturazione risultante. Ad esempio, l'affinità di legame è stata determinata utilizzando amivantamab radiomarcato, un anticorpo bispecifico per il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le proteine di transizione mesenchimale-epiteliale citoplasmatica (cMET).

Introduzione

Gli anticorpi radiomarcati (rAb) hanno una varietà di usi in medicina. Mentre la maggior parte sono utilizzati in oncologia come agenti di imaging e terapeutici, ci sono applicazioni di imaging per l'infiammazione correlata alla reumatologia, la cardiologia e la neurologia¹. Imaging rAbs ha un'alta sensibilità per rilevare le lesioni e ha il potenziale per aiutare nella selezione del paziente per il trattamento 2,3,4,5. Sono anche usati per la terapia a causa della loro specificità per i rispettivi antigeni. In una st....

Protocollo

NOTA: fare riferimento alla Figura 2 per una rappresentazione grafica del protocollo.

Figura 2: Schema del protocollo. Le etichette di riga e colonna sono indicate come guida per la configurazione della piastra frangibile a 96 pozzetti. Il legame antici....

Risultati

Questo metodo calcola l'affinità di legame (K_D) per un rAb in base al saggio di legame di saturazione in cui diverse concentrazioni di rAb sono state aggiunte a una quantità fissa di antigene immobilizzato. La curva di legame dovrebbe seguire la crescita logaritmica dove è inizialmente ripida e poi si stabilizza quando l'antigene è saturo. Per garantire che il K_D determinato sia accurato, le concentrazioni di rAb devono essere abbastanza alte da raggiungere la saturazione. Per questo test, gli antic.......

Discussione

Come parte dello sviluppo di rAbs, è importante garantire che un rAb si leghi specificamente al suo target con un'elevata affinità di legame. La determinazione dell'affinità di legame può informare se l'immunoreattività del rAb è influenzata dalla radioconiugazione attraverso il test di saturazione del radioligato utilizzando l'antigene immobilizzato. La determinazione del legame di rAb alla BSA può essere utilizzata per quantificare il legame non specifico per misurare il legame specifico all'antigene immobilizzato in m.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Contatore gamma		Hidex Hidex Contatore
GraphPad Prism Software	GraphPad		versione 9.2; utilizzato per analisi statistiche in questo studio
Piastre MaxiSorp a 96 pozzetti Immuno Breakable Nastro	per		Thermo Scientific
	Corning	4612
Microsoft Excel
(PBS)	Gibco	14190144
Bicarbonato di sodio	JT Baker	3506-01
Carbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949

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