Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen
Summary
Het huidige protocol beschrijft het voorbereiden en gebruiken van precisiegesneden longplakken van muizen om de luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spiercontractiliteit in een bijna in vivo omgeving te beoordelen.
Abstract
Gladde spiercellen (SMC) bemiddelen de samentrekking van de luchtwegen en de intrapulmonale slagader om respectievelijk de luchtstroomweerstand en de pulmonale circulatie te wijzigen, waardoor ze een cruciale rol spelen in de homeostase van het longsysteem. Deregulering van SMC-contractiliteit draagt bij aan verschillende longziekten, waaronder astma en pulmonale hypertensie. Vanwege de beperkte toegang tot weefsel en een gebrek aan kweeksystemen om in vivo SMC-fenotypen te behouden, blijven moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gedereguleerde SMC-contractiliteit bij deze ziekten echter volledig geïdentificeerd. De precision-cut lung slice (PCLS) biedt een ex vivo model dat deze technische problemen omzeilt. Als een levende, dunne longweefselsectie behoudt de PCLS SMC in een natuurlijke omgeving en maakt het in situ tracking van SMC-contractie en intracellulaire Ca2 + -signalering mogelijk die de SMC-contractiliteit reguleert. Hier wordt een gedetailleerd PCLS-voorbereidingsprotocol voor muizen verstrekt, dat intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders behoudt. Dit protocol omvat twee essentiële stappen voordat de longkwab aan snijwonden wordt onderworpen: het opblazen van de luchtweg met laagsmeltpunt agarose door de luchtpijp en het vullen van longvaten met gelatine door de rechter ventrikel. De PCLS bereid met behulp van dit protocol kan worden gebruikt voor bioassays om Ca2+-gemedieerde contractiele regulatie van SMC in zowel de luchtwegen als de intrapulmonale arteriële compartimenten te evalueren. Toegepast op muismodellen van luchtwegaandoeningen maakt dit protocol het functioneel onderzoek van SMC mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in het onderliggende mechanisme van SMC-contractiliteitsderegulatie bij ziekten.
Introduction
Gladde spiercel (SMC) is een belangrijk structureel celtype in de longen, voornamelijk woonachtig in de mediawand van luchtwegen en longvaten. SMC’s trekken samen om het luminale kaliber te veranderen, waardoor de lucht- en bloedstroomwordt geregeld 1,2. Daarom is contractiele regulatie van SMC’s essentieel om de homeostase van luchtventilatie en pulmonale circulatie te behouden. Afwijkende SMC-contractiliteit daarentegen veroorzaakt obstructieve luchtweg- of pulmonale vaatziekten zoals astma en pulmonale arteriële hypertensie. De functionele beoordeling van long-SMC’s is echter uitgedaagd door beperkte toegang tot het longweefsel, met name die kleine luchtwegen en microvessels in het distale deel van de long 2,3. Huidige oplossingen nemen hun toevlucht tot indirecte testen, zoals het meten van luchtstroomweerstand door Flexivent om luchtwegvernauwing te weerspiegelen, en het controleren van pulmonale arteriële bloeddruk door rechterhartkatheterisatie om pulmonale vasocontractie te beoordelen 4,5. Deze indirecte testen hebben echter meerdere nadelen, zoals verward worden door structurele factoren, het niet vastleggen van de ruimtelijke diversiteit van luchtweg- of vasculaire reacties in de hele longschaal 6,7, en ongeschikt voor de mechanistische studie van contractiele regulatie op cellulair niveau. Daarom zijn alternatieve benaderingen met behulp van geïsoleerde primaire cellen, luchtpijp /bronchiën spierstrips 8,9 of grote vasculaire segmenten10 toegepast voor de SMC-studie in vitro. Toch hebben deze methoden ook beperkingen. Een snelle fenotypische aanpassing van primaire SMC’s in de kweekconditie11,12 maakt het bijvoorbeeld problematisch om bevindingen uit celcultuur naar in vivo instellingen te extrapoleren. Bovendien vertegenwoordigt het contractiele fenotype van SMC’s in de geïsoleerde proximale luchtweg- of vasculaire segmenten mogelijk niet de SMC’s in de distale long 6,7. Bovendien blijft de spierkrachtmeting op weefselniveau losgekoppeld van moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die essentieel zijn voor mechanistisch inzicht in contractiele regulatie.
Precision-cut lung slice (PCLS), een levend longweefselgedeelte, biedt een ideaal ex vivo hulpmiddel om pulmonale SMC’s te karakteriseren in een bijna in vivo micro-omgeving (d.w.z. bewaarde multicellulaire architectuur en interactie)13. Sinds Drs. Placke en Fisher voor het eerst de bereiding van longplakken van agarose-opgeblazen ratten- en hamsterlongen introduceerden in de jaren1980 14,15, is deze techniek voortdurend geavanceerd om PCLS’en te voorzien van hogere kwaliteit en grotere veelzijdigheid voor biomedisch onderzoek. Een belangrijke verbetering is de verbetering van pulmonale arteriële conservering door gelatine-infusie naast longinflatie met agarose via de luchtpijp. Als gevolg hiervan worden zowel de luchtweg als de longslagader intact gehouden in de PCLS voor ex vivo beoordeling16. Bovendien is de PCLS levensvatbaar voor een langere tijd in cultuur. Bijvoorbeeld, muis PCLS’en hadden geen significante verandering in de levensvatbaarheid van de cel en het metabolisme gedurende minimaal 12 dagen in cultuur, evenals, ze behielden de contractiliteit van de luchtwegen gedurende maximaal 7 dagen17. Bovendien houdt PCLS luchtwegen of bloedvaten van verschillende grootte bij voor contractie- en ontspanningstests. Bovendien kan intracellulaire Ca2+ signalering van SMC’s, de determinante factor van celcontractiliteit, worden getest met Ca2+ reporterkleurstoffen afgebeeld door een confocale of 2-fotonenmicroscoop13.
Gezien de uitgebreide toepassing van het muismodel in longonderzoek, wordt hier een gedetailleerd protocol beschreven voor het voorbereiden van muis PCLS met intacte luchtwegen en intrapulmonale slagaders voor ex vivo longonderzoek. Met behulp van de voorbereide PCLS’en hebben we vervolgens aangetoond hoe we de luchtweg- en pulmonale arteriële reacties op vernauwende of ontspannende stimuli kunnen evalueren. Daarnaast wordt ook de methode beschreven om de PCLS te laden met Ca2+ reporterkleurstof en vervolgens Ca2+ signalering van SMC’s geassocieerd met contractiele of relaxante reacties in beeld te brengen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De voorbereiding van PCLS omvat verschillende kritieke stappen. Ten eerste is het essentieel om de longkwab homogeen op te blazen om de variatie van weefselstijfheid door ongelijke agaroseverdeling te voorkomen. Aangezien de vloeistof snel in dunne katheters of luchtwegen gels bij een temperatuur onder 37 °C, kan het resulterende vuldefect in het distale longveld de ongelijkheid van longweefselstijfheid vergroten en weefselscheuren veroorzaken tijdens de vibratomsectie. Daarom kan worden geoefend om de laagsmeltende aga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
Riferimenti
- Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
- Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
- Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
- McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
- Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
- Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
- Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
- Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
- Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
- Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
- Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
- Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
- Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
- Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
- Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
- Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
- Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
- Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
- Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
- Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
- Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
- Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
- Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
- Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).
