Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

Summary

Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .

Abstract

Les cellules musculaires lisses (SMC) médient la contraction des voies respiratoires et de l’artère intrapulmonaire pour modifier la résistance au flux d’air et la circulation pulmonaire, respectivement, jouant ainsi un rôle essentiel dans l’homéostasie du système pulmonaire. La dérégulation de la contractilité SMC contribue à plusieurs maladies pulmonaires, y compris l’asthme et l’hypertension pulmonaire. Cependant, en raison de l’accès limité aux tissus et d’un manque de systèmes de culture pour maintenir les phénotypes SMC in vivo , les mécanismes moléculaires sous-jacents à la contractilité DÉRÉGULée du SMC dans ces maladies restent pleinement identifiés. La tranche de poumon découpée avec précision (PCLS) offre un modèle ex vivo qui contourne ces difficultés techniques. En tant que section de tissu pulmonaire mince et vivant, le PCLS retient le SMC dans un environnement naturel et permet un suivi in situ de la contraction du SMC et de la signalisation intracellulaire Ca²⁺ qui régule la contractilité du SMC. Ici, un protocole détaillé de préparation PCLS de souris est fourni, qui préserve les voies respiratoires intactes et les artères intrapulmonaires. Ce protocole implique deux étapes essentielles avant de soumettre le lobe pulmonaire au tranchage: gonfler les voies respiratoires avec de l’agarose à faible point de fusion à travers la trachée et remplir les vaisseaux pulmonaires de gélatine à travers le ventricule droit. Le PCLS préparé à l’aide de ce protocole peut être utilisé pour des essais biologiques afin d’évaluer la régulation contractile médiée par ca²⁺ de la SMC dans les voies respiratoires et les compartiments artériels intrapulmonaires. Lorsqu’il est appliqué à des modèles murins de maladies respiratoires, ce protocole permet l’étude fonctionnelle de la SMC, fournissant ainsi un aperçu du mécanisme sous-jacent de la dérégulation de la contractilité SMC dans les maladies.

Introduction

La cellule musculaire lisse (SMC) est un type de cellule structurelle majeur dans le poumon, résidant principalement dans la paroi médiale des voies respiratoires et des vaisseaux pulmonaires. Les SMC se contractent pour modifier le calibre luminal, régulant ainsi le flux d’air et de sang ^1,2. Par conséquent, la régulation contractile des SMC est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la ventilation de l’air et de la circulation pulmonaire. En revanche, la contractilité aberrante du SMC provoque des maladies vasculaires obstructives ou pulmonaires comme l’asthme et l’hypertension artérielle pulmonaire. Cependant, l’évaluation fonctionnelle des SMC pulmonaires a été remise en question par un accès limité au tissu pulmonaire, en particulier aux petites voies respiratoires et aux microvaisseaux dans la partie distale du poumon ^2,3. Les solutions actuelles ont recours à des tests indirects, tels que la mesure de la résistance au flux d’air par Flexivent pour refléter la constriction des voies respiratoires et la vérification de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit pour évaluer la vasocontraction pulmonaire ^4,5. Cependant, ces essais indirects présentent de multiples inconvénients, tels que le fait d’être confondus par des facteurs structurels, de ne pas capturer la diversité spatiale des réponses vasculaires ou vasculaires dans l’ensemble de ^{l’échelle pulmonaire 6,7} et de ne pas convenir à l’étude mécaniste de la régulation contractile au niveau cellulaire. Par conséquent, des approches alternatives utilisant des cellules primaires isolées,^des bandes musculaires trachées/ bronchiques ^8,9 ou de grands segments vasculaires¹⁰ ont été appliquées pour l’étude SMC in vitro. Néanmoins, ces méthodes ont également des limites. Par exemple, une adaptation phénotypique rapide des SMC primaires dans la condition de culture^11,12 rend problématique l’extrapolation des résultats de la culture cellulaire aux contextes in vivo. De plus, le phénotype contractile des SMC dans les voies respiratoires proximales isolées ou les segments vasculaires peut ne pas représenter les SMC dans le poumon distal ^6,7. De plus, la mesure de la force musculaire au niveau tissulaire reste dissociée des événements moléculaires et cellulaires qui sont essentiels pour la compréhension mécaniste de la régulation contractile.

La tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS), une section de tissu pulmonaire vivant, fournit un outil ex vivo idéal pour caractériser les SMC pulmonaires dans un microenvironnement quasi in vivo (c.-à-d. architecture et interaction multicellulaires préservées)¹³. Depuis que les Drs Placke et Fisher ont introduit pour la première fois la préparation de tranches pulmonaires à partir de poumons de rat et de hamster gonflés à l’agarose dans les années 1980 ^14,15, cette technique a été continuellement avancée pour fournir aux PCLS une qualité supérieure et une plus grande polyvalence pour la recherche biomédicale. Une amélioration significative est l’amélioration de la préservation artérielle pulmonaire par perfusion de gélatine en plus de l’inflation pulmonaire avec l’agarose via la trachée. En conséquence, les artères respiratoires et pulmonaires sont maintenues intactes dans le PCLS pour l’évaluation ex vivo ¹⁶. De plus, le PCLS est viable pendant une période prolongée en culture. Par exemple, les PCLS de souris n’ont eu aucun changement significatif dans la viabilité cellulaire et le métabolisme pendant au moins 12 jours en culture, ainsi que, ils ont conservé la contractilité des voies respiratoires jusqu’à 7 jours¹⁷. En outre, PCLS conserve des voies respiratoires ou des vaisseaux de différentes tailles pour les tests de contraction et de relaxation. De plus, la signalisation intracellulaire Ca²⁺ des SMC, le facteur déterminant de la contractilité cellulaire, peut être dosée avec des colorants rapporteurs Ca²⁺ imagés par un microscope confocal ou à 2 photons¹³.

Compte tenu de l’application étendue du modèle murin dans la recherche pulmonaire, un protocole détaillé est décrit ici pour préparer le PCLS de souris avec des voies respiratoires et des artères intrapulmonaires intactes pour la recherche pulmonaire ex vivo . À l’aide des LPC préparés, nous avons ensuite démontré comment évaluer les réponses artérielles et pulmonaires aux stimuli constrictifs ou relaxants. En outre, la méthode de chargement du PCLS avec un colorant rapporteur Ca²⁺ , puis l’imagerie de la signalisation Ca²⁺ des SMC associés à des réponses contractiles ou relaxantes sont également décrites.

Protocol

Tous les soins aux animaux étaient conformes aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee du Massachusetts General Hospital. Des souris mâles de type sauvage C57/B6, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. 1. Préparation expérimentale Préparez la solution de travail. Préparez 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS, avec Ca2+ et Mg2+, et pH équilibré avec 20 mM HEPES, voir …

Representative Results

Préparation pcLS de souris préservant les voies respiratoires et les artères intrapulmonaires intactesUn PCLS de 150 μm d’épaisseur a été observé au microscope à contraste de phase inversé. Dans les poumons de souris, les voies respiratoires conductrices sont accompagnées d’artères intrapulmonaires, allant du hile au poumon périphérique. Un faisceau sinusoïdal-artère pulmonaire représentatif dans un PCLS de souris est illustré à la figure 2B. Les v…

Discussion

La préparation du PCLS implique plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est essentiel de gonfler le lobe pulmonaire de manière homogène pour éviter la variation de la rigidité tissulaire due à une distribution inégale de l’agarose. Comme l’agarose liquide se gélifie rapidement dans de minces cathéters ou des voies respiratoires à une température inférieure à 37 ° C, le défaut de remplissage résultant dans le champ pulmonaire distal pourrait augmenter la disparité de la rigidité du tissu pulm…

Materials

1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter