精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究
Summary
本プロトコールは、マウスの精密切断肺スライスを調製し、利用して、ほぼ in vivo環境における 気道および肺内動脈平滑筋収縮性を評価することを記載している。
Abstract
平滑筋細胞(SMC)は、気道および肺内動脈の収縮を媒介して、それぞれ気流抵抗および肺循環を変化させ、したがって肺系の恒常性において重要な役割を果たしている。SMC収縮性の調節解除は、喘息および肺高血圧症を含むいくつかの肺疾患に寄与する。しかしながら、組織アクセスが制限され、インビボSMC表現型を維持するための培養系の欠如のために、これらの疾患における制御解除されたSMC収縮性の根底にある分子機構は完全に同定されたままである。精密切断肺スライス(PCLS)は、これらの技術的困難を回避するex vivoモデルを提供します。生きた薄い肺組織切片として、PCLSは自然環境においてSMCを保持し、SMC収縮およびSMC収縮性を調節する細胞内Ca2+シグナル伝達のその場での追跡を可能にする。ここでは、無傷の気道および肺内動脈を保存する詳細なマウスPCLS調製プロトコルが提供される。このプロトコルには、肺葉をスライスする前に、気管を通る低融点アガロースで気道を膨張させることと、右心室を通して肺血管にゼラチンを充填することの2つの重要なステップが含まれます。このプロトコルを使用して調製されたPCLSは、気道および肺内動脈区画の両方におけるSMCのCa2+媒介性収縮調節を評価するためのバイオアッセイに使用することができる。呼吸器疾患のマウスモデルに適用すると、このプロトコルはSMCの機能的調査を可能にし、それによって疾患におけるSMC収縮性調節緩和の根底にあるメカニズムへの洞察を提供する。
Introduction
平滑筋細胞(SMC)は、肺の主要な構造細胞型であり、主に気道および肺血管の培地壁に常在する。SMCは管腔口径を変化させるために収縮し、空気と血流を調節する 1,2.したがって、SMCの収縮性調節は、空気換気および肺循環の恒常性を維持するために不可欠である。対照的に、異常なSMC収縮性は、閉塞性気道または喘息および肺動脈性高血圧症のような肺血管疾患を引き起こす。しかしながら、肺SMCの機能評価は、肺組織、特に肺の遠位部にあるそれらの小さな気道および微小血管への限られたアクセスによって挑戦されてきた2,3。現在のソリューションは、気道狭窄を反映するためにFlexiventによって気流抵抗を測定し、肺血管収縮を評価するために右心カテーテル法によって肺動脈血圧をチェックするなどの間接アッセイに頼っています4,5。しかし、これらの間接アッセイには、構造的要因によって交絡される、肺スケール全体における気道または血管応答の空間的多様性を捉えることができない、細胞レベルでの収縮調節の機構的研究に適さないなど、複数の欠点がある。したがって、単離された初代細胞、気管/気管支筋ストリップ8、9、または大きな血管セグメント10を使用する代替アプローチが、インビトロでのSMC研究に適用されている。それにもかかわらず、これらの方法にも制限があります。例えば、培養条件11、12における初代SMCの迅速な表現型適応は、細胞培養からインビボ設定への所見を推定することを問題にする。加えて、単離された近位気道または血管セグメントにおけるSMCsの収縮表現型は、遠位肺におけるSMCsを表していなくてもよい6,7。さらに、組織レベルでの筋力測定は、収縮調節への機構的洞察に不可欠な分子的および細胞的事象から解離したままである。
生きた肺組織切片である精密切断肺スライス(PCLS)は、生体内に近い微小環境(すなわち、保存された多細胞構造と相互作用)で肺SMCを特徴付けるための理想的なエクスビボツールを提供します13。Placke博士とFisher博士が1980年代にアガロースで膨張したラットとハムスターの肺からの肺スライスの調製を初めて導入して以来、14,15、この技術はPCLSに生物医学研究のためのより高い品質と汎用性を提供するために継続的に進歩してきました。1つの重要な改善は、気管を介したアガロースによる肺膨張に加えて、ゼラチン注入による肺動脈保存の増強である。その結果、気道および肺動脈の両方が、エクスビボアッセイ16のためのPCLSにおいて無傷に保たれる。さらに、PCLSは、培養において長期間にわたって生存可能である。例えば、マウスPCLSは、培養において最低12日間、細胞生存率および代謝に有意な変化を示さず、ならびに、気道収縮性を最大7日間保持した17。さらに、PCLSは収縮およびリラクゼーションアッセイのために異なるサイズの気道または血管を保持します。さらに、SMCsの細胞内Ca2+シグナル伝達は、細胞収縮性の決定因子であり、共焦点または2光子顕微鏡13によって画像化されたCa2+レポーター色素を用いてアッセイすることができる。
肺研究におけるマウスモデルの広範な適用を考慮すると、 エクスビボ 肺研究のために無傷の気道および肺内動脈を有するマウスPCLSを調製するための詳細なプロトコルがここに記載されている。調製したPCLSを用いて、我々はその後、狭窄性または弛緩性刺激に対する気道および肺動脈応答を評価する方法を実証した。さらに、PCLSにCa2+ レポーター色素をロードし、次いで収縮性または弛緩性応答に関連するSMCのCa2+ シグナル伝達をイメージングする方法も記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
PCLSの準備には、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、不均一なアガロース分布からの組織剛性の変動を避けるために、肺葉を均質に膨張させることが不可欠である。液体アガロースは、37°C未満の温度で薄いカテーテルまたは気道で急速にゲル化するので、結果として生じる遠位肺野の充填欠陥は、肺組織の硬さの格差を増加させ、ビブラトーム切片中に組織を引き裂く可能性が?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH grants, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) によってサポートされています。
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
Riferimenti
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