Den nåværende protokollen beskriver å forberede og bruke musepresisjonskuttede lungeskiver for å vurdere luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskelkontraktilitet i et nesten in vivo miljø.
Glatte muskelceller (SMC) formidler sammentrekningen av luftveien og den intrapulmonale arterien for å modifisere henholdsvis luftstrømmotstand og lungesirkulasjon, og spiller dermed en kritisk rolle i homeostase av lungesystemet. Deregulering av SMC-kontraktilitet bidrar til flere lungesykdommer, inkludert astma og pulmonal hypertensjon. På grunn av begrenset vevstilgang og mangel på dyrkningssystemer for å opprettholde in vivo SMC-fenotyper, forblir imidlertid molekylære mekanismer som ligger til grunn for den deregulerte SMC-kontraktiliteten i disse sykdommene fullstendig identifisert. Den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) tilbyr en ex vivo-modell som omgår disse tekniske vanskelighetene. Som en levende, tynn lungevevsseksjon beholder PCLS SMC i naturlige omgivelser og tillater in situ-sporing av SMC-sammentrekning og intracellulær Ca2+- signalering som regulerer SMC-kontraktilitet. Her er en detaljert mus PCLS forberedelsesprotokoll gitt, som bevarer intakte luftveier og intrapulmonale arterier. Denne protokollen innebærer to viktige trinn før du utsetter lungelappen for kutting: oppblåsing av luftveiene med lavsmeltepunktsagarose gjennom luftrøret og innfylling av lungekar med gelatin gjennom høyre ventrikel. PCLS fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan brukes til bioassays for å evaluere Ca2 + -mediert kontraktil regulering av SMC i både luftveier og intrapulmonale arterielle rom. Når den brukes på musemodeller av respiratoriske sykdommer, muliggjør denne protokollen funksjonell undersøkelse av SMC, og gir dermed innsikt i den underliggende mekanismen for SMC-kontraktilitetsderegulering i sykdommer.
Glatt muskelcelle (SMC) er en viktig strukturell celletype i lungen, primært bosatt i medieveggen i luftveiene og lungekarene. SMC-er trekker seg sammen for å endre luminalkaliberet, og dermed regulere luft og blodstrøm 1,2. Derfor er kontraktil regulering av SMC avgjørende for å opprettholde homeostase av luftventilasjon og lungesirkulasjon. I motsetning til dette fremkaller avvikende SMC-kontraktilitet obstruktiv luftvei eller lunge vaskulære sykdommer som astma og pulmonal arteriell hypertensjon. Den funksjonelle vurderingen av lunge-SMCer har imidlertid blitt utfordret av begrenset tilgang til lungevevvet, spesielt de små luftveiene og mikroveslene i den distale delen av lungen 2,3. Nåværende løsninger benytter seg av indirekte analyser, for eksempel måling av luftstrømmotstand av Flexivent for å reflektere luftveisinnsnevring, og kontroll av pulmonalt arterielt blodtrykk ved høyre hjertekateterisering for å vurdere pulmonal vasokokontraksjon 4,5. Imidlertid har disse indirekte analysene flere ulemper, for eksempel å bli forvirret av strukturelle faktorer, ikke fange det romlige mangfoldet av luftveier eller vaskulære responser i helelungeskalaen 6,7, og uegnet for den mekanistiske studien av kontraktil regulering på mobilnivå. Derfor har alternative tilnærminger ved bruk av isolerte primære celler, luftrør / bronkie muskelstrimler 8,9 eller store vaskulære segmenter10 blitt brukt for SMC-studien in vitro. Likevel har disse metodene også begrensninger. For eksempel gjør en rask fenotypisk tilpasning av primære SMCer i kulturtilstanden 11,12 det problematisk å ekstrapolere funn fra cellekultur til in vivo-innstillinger. I tillegg kan den kontraktile fenotypen av SMC i de isolerte proksimale luftveis- eller vaskulære segmentene ikke representere SMC-ene i den distale lungen 6,7. Videre forblir muskelkraftmålingen på vevsnivå dissosiert fra molekylære og cellulære hendelser som er avgjørende for mekanistisk innsikt i kontraktil regulering.
Presisjonskuttet lungeskive (PCLS), en seksjon for levende lungevev, gir et ideelt ex vivo-verktøy for å karakterisere lunge-SMCer i et nær in vivo mikromiljø (dvs. bevart multicellulær arkitektur og interaksjon)13. Siden Dr. Placke og Fisher først introduserte tilberedningen av lungeskiver fra agaroseoppblåste rotte- og hamsterlunger på 1980-tallet14,15, har denne teknikken blitt avansert kontinuerlig for å gi PCLSer høyere kvalitet og større allsidighet for biomedisinsk forskning. En signifikant forbedring er forbedring av pulmonal arteriell bevaring ved gelatininfusjon i tillegg til lungeinflasjon med agarose via luftrøret. Som et resultat holdes både luftveier og lungearterier intakte i PCLS for ex vivo-vurdering 16. Videre er PCLS levedyktig i lengre tid i kulturen. For eksempel hadde mus PCLSer ingen signifikant endring i cellens levedyktighet og metabolisme i minst 12 dager i kultur, så vel som de beholdt luftveiskontraktiliteten i opptil 7 dager17. I tillegg holder PCLS forskjellige størrelser luftveier eller fartøy for sammentrekning og avslapningsanalyser. Videre kan intracellulær Ca2+ signalering av SMC, den determinantfaktoren for cellekontraktilitet, analyseres med Ca2+ reporterfarger avbildet av et konfokalt eller 2-foton mikroskop13.
Med tanke på den omfattende anvendelsen av musemodellen i lungeforskning, er en detaljert protokoll beskrevet her for å forberede mus PCLS med intakte luftveier og intrapulmonale arterier for ex vivo lungeforskning. Ved hjelp av de forberedte PCLSene demonstrerte vi deretter hvordan man evaluerer luftveis- og lungearterieresponsene på konstriktive eller relakserende stimuli. I tillegg beskrives også metoden for å laste PCLS med Ca2+ reporterfargestoff og deretter avbilde Ca2+- signalering av SMC-er assosiert med kontraktile eller relakserende responser.
Utarbeidelsen av PCLS innebærer flere kritiske trinn. For det første er det viktig å blåse opp lungelappen homogent for å unngå variasjon av vevsstivhet fra ujevn agarosefordeling. Siden væsken agarose raskt gelerer i tynne katetre eller luftveier ved en temperatur under 37 °C, kan den resulterende fyllingsdefekten i det distale lungefeltet øke forskjellen i stivhet i lungevevet og forårsake vevsrivning under vibratomsnittet. Derfor kan det praktiseres å holde den lavsmeltende agaroseoppløsningen ved 42 °C i…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av NIH tilskudd, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
1 mL syringe | BD | 309626 | |
15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
3 mL syringe | BD | 309585 | |
50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |