Sulla base della famiglia di cardiomiopatie ereditarie familiari trovata nel nostro lavoro clinico, abbiamo creato un modello murino C57BL / 6N con una mutazione puntiforme (G823E) nel locus MYH7 del topo attraverso l'ingegneria del genoma mediata da CRISPR / Cas9 per verificare questa mutazione.
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Articolo metodologico
Studio della patogenesi della mutazione MYH7 Gly823Glu nella cardiomiopatia ipertrofica familiare utilizzando un modello murino
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cardiomiopatia ipertrofica familiare (HCM, OMIM: 613690) è la cardiomiopatia più comune in Cina. Tuttavia, l'eziologia genetica sottostante della CMI rimane elusiva.
Abbiamo precedentemente identificato una variante eterozigote del gene della miosina a catena pesante 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), in una grande famiglia Han cinese con HCM. In questa famiglia, la variante G823E cosegrega con una malattia autosomica dominante. Questa variante si trova nel dominio del braccio di leva della regione del collo della proteina MYH7 ed è altamente conservata tra le miosine e le specie omologhe. Per verificare la patogenicità della variante G823E, abbiamo prodotto un modello murino C57BL/6N con una mutazione puntiforme (G823E) nel locus del topo MYH7 con ingegneria genomica mediata da CRISPR / Cas9. Abbiamo progettato vettori bersaglio del gRNA e oligonucleotidi del donatore (con sequenze di targeting affiancate da 134 bp di omologia). Il sito p.G823E (da GGG a GAG) nell'oligonucleotide donatore è stato introdotto nell'esone 23 di MYH7 mediante riparazione diretta dall'omologia. È stato anche inserito un p.R819 silenziato (da AGG a CGA) per prevenire il legame del gRNA e la ri-scissione della sequenza dopo la riparazione diretta dall'omologia. L'ecocardiografia ha rivelato ipertrofia della parete posteriore ventricolare sinistra (LVPW) con sistole nei topi MYH7 G823E/- a 2 mesi di età. Anche questi risultati sono stati convalidati dall'analisi istologica (Figura 3).
Questi risultati dimostrano che la variante G823E svolge un ruolo importante nella patogenesi dell'HCM. I nostri risultati arricchiscono lo spettro delle varianti di MYH7 legate alla CMI familiare e possono fornire una guida per la consulenza genetica e la diagnosi prenatale in questa famiglia cinese.
Introduzione
La cardiomiopatia ipertrofica (HCM, OMIM: 613690) è la cardiomiopatia più comune in Cina, con un'incidenza stimata dello 0,2%, che colpisce 150.000 persone 1,2.
La caratteristica anatomica patologica che caratterizza la CMI è l'ipertrofia ventricolare asimmetrica, che spesso coinvolge il tratto di efflusso ventricolare e/o il setto interventricolare3. La manifestazione clinica è dispnea da sforzo, affaticamento e dolore toracico. Il fenotipo individuale della CMI ha una variabilità che varia da clinicamente insidiosa a grave insufficienza cardiaca. I pazienti....
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Protocollo
Le storie delle famiglie sono state ottenute intervistando i membri della famiglia. Lo studio è stato approvato dal Comitato etico dell'ospedale provinciale di medicina cinese del Guangdong (n. 2019074). Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i membri della famiglia. Tutti gli animali sono trattati in conformità con le linee guida etiche dell'Ospedale provinciale di medicina cinese del Guangdong (Guangzhou, Cina).
1. Materie di studio
NOTA: Il probando III-3 ha richiesto un parere medico nel Dipartimento di Chirurgia Cardiovascolare dell'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del ....
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Risultati
Profilo clinico delle famiglie
I pedigree familiari di HCM sono stati ottenuti e sono mostrati nella Figura 2. Tutti i membri della famiglia documentati sono stati diagnosticati con HCM al momento dell'iscrizione.
Nella famiglia (Figura 2A), il probando era il paziente III-7, a cui è stata diagnosticata la CMI e l'ostruzione del tratto di efflusso ventricolare sinistro (LVOTO) a 46 anni e ha subito un intervento chirurgico cardiaco.......
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Discussione
In questo studio, descriviamo una famiglia Han cinese con HCM. L'analisi genetica ha rivelato che una mutazione eterozigote di MYH6 p.G823E co-segrega con la malattia nei membri della famiglia con trasmissione autosomica dominante. Per convalidare la patogenicità della mutazione G823E e discutere i meccanismi sottostanti, abbiamo creato un modello murino C57BL/6N con G823E nel locus Myh7 del topo mediante ingegneria genomica mediata da CRISPR / Cas9.
Le caratteristiche fenotipiche dei topi kno.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Medical Research Fund della provincia del Guangdong (A2022363) e dal grande progetto del Guangdong Committee of Science and Technology, Cina (sovvenzione n. 2022).
Vorremmo ringraziare Qingjian Chen dell'Università del Maryland, College Park per l'aiuto durante la preparazione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 volte; TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2&volte; Fornitore verificato - Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarosio | Regu | ||
| Macchina per anestesia per piccoli animali | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| in vitro per rilevare il kit di efficienza del bersaglio del gRNA | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| Marcatore DNA | Thermo Fisher Scientific | ||
| Stabilizzatore del DNA | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevenire la degradazione del DNA |
| Microtomo elettrico di paraffina | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene kit di sangue | Santa Clara | ||
| Vetrino, vetrino coprioggetti | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Soluzione colorante ematossilina, soluzione colorante eosina | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| La piattaforma HiSeq X-ten | Illumina | esegue il sequenziamento sulle librerie catturate | |
| Iniezione di gonadotropina corionica | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Iniezione di gonadotropina sierica di cavalla gravida | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurano | Fornitori | inalazione anestesia | |
| Microiniezione microscopio | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffina Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinasi K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequenziatore | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscopio | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | per esoma | |
| Kit di mRNA T7 ARCA | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Scatola di temperatura | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Soluzione di cloridrato | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Ecografo veterinario | Royal Philips | CX50 |
Riferimenti
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al.
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Ristampe e permessi
