التحقيق في التسبب في طفرة MYH7 Gly823Glu في اعتلال عضلة القلب الضخامي العائلي باستخدام نموذج الماوس
Summary
استنادا إلى عائلة اعتلال عضلة القلب الوراثي العائلي الموجودة في عملنا السريري ، أنشأنا نموذج فأر C57BL / 6N مع طفرة نقطية (G823E) في موضع الفأر MYH7 من خلال هندسة الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9 للتحقق من هذه الطفرة.
Abstract
اعتلال عضلة القلب الضخامي العائلي (HCM ، OMIM: 613690) هو اعتلال عضلة القلب الأكثر شيوعا في الصين. ومع ذلك ، فإن المسببات الوراثية الأساسية ل HCM لا تزال بعيدة المنال.
لقد حددنا سابقا متغير جين متغاير الزيجوت ذو سلسلة الميوسين الثقيلة 7 (MYH7) ، NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) ، في عائلة هان صينية كبيرة مع HCM. في هذه العائلة ، يفصل المتغير G823E مع اضطراب صبغي جسدي سائد. يقع هذا البديل في مجال ذراع الرافعة في منطقة الرقبة لبروتين MYH7 ويتم حفظه بشكل كبير بين الميوسين والأنواع المتماثلة. للتحقق من إمراضية متغير G823E ، أنتجنا نموذج ماوس C57BL / 6N مع طفرة نقطية (G823E) في موضع الفأر MYH7 مع هندسة الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9. لقد صممنا gRNA التي تستهدف النواقل وقليل النيوكليوتيدات المانحة (مع تسلسل استهداف محاط ب 134 نقطة أساس من التماثل). تم إدخال موقع p.G823E (GGG إلى GAG) في قليل النوكليوتيد المانح في إكسون 23 من MYH7 عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل. كما تم إدخال p.R819 صامت (AGG إلى CGA) لمنع ارتباط gRNA وإعادة انشقاق التسلسل بعد الإصلاح الموجه بالتماثل. كشف تخطيط صدى القلب عن تضخم جدار البطين الخلفي الأيسر (LVPW) مع الانقباض في الفئران MYH7 G823E / – في عمر شهرين. تم التحقق من صحة هذه النتائج أيضا من خلال التحليل النسيجي (الشكل 3).
توضح هذه النتائج أن متغير G823E يلعب دورا مهما في التسبب في HCM. تثري النتائج التي توصلنا إليها طيف متغيرات MYH7 المرتبطة ب HCM العائلي وقد توفر إرشادات للاستشارة الوراثية والتشخيص قبل الولادة في هذه العائلة الصينية.
Introduction
اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM ، OMIM: 613690) هو اعتلال عضلة القلب الأكثر شيوعا في الصين ، حيث يقدر حدوثه بنسبة 0.2٪ ، مما يؤثر على 150,000 شخص 1,2.
السمة التشريحية المرضية التي تميز HCM هي تضخم البطين غير المتماثل ، والذي غالبا ما ينطوي على مجرى تدفق البطين و / أو الحاجز بين البطينين3. المظهر السريري هو ضيق التنفس المجهد ، والتعب ، وألم في الصدر. النمط الظاهري الفردي ل HCM له تباين يتراوح من غدرا سريريا إلى قصور القلب الحاد. يحتاج المرضى الذين يعانون من HCM إلى علاج طبي وزرع قلب ومعدات دعم الحياة ومتابعة متعددة التخصصات4.
في القرن الماضي ، غيرت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الطريقة التي ندرس بها الحمض النووي5. تم اكتشاف طريقة تسلسل الحمض النووي للتشخيص السريري من قبل سانجر وزملائه6. تم تطبيق تقنية سانجر لاحقا على مشروع الجينوم البشري ، لكن هذا النهج كان مكلفا ويستغرق وقتا طويلا7. أدى ظهور تسلسل الجينوم الكامل (WGS) إلى رفع نظرة ثاقبة للأمراض الوراثية البشرية إلى آفاق جديدة ، لكنه ظل باهظا من حيث التكلفة. تستخدم تقنية تسلسل الإكسوم الكامل (WES) منذ فترة طويلة للكشف عن متغيرات الخط الجرثومي8 ونجحت في تحديد طفرات المحرك الجسدي في إكسوم السرطانات المختلفة9. يمكن استخدام الكشف عن إكسونات الحمض النووي أو مناطق الترميز بواسطة WES للكشف عن المتغيرات المسببة للأمراض في معظم الأمراض المندلية. اليوم ، مع انخفاض تكلفة التسلسل ، من المتوقع أن يصبح WGS أداة مهمة في أبحاث الجينوم ويمكن استخدامه على نطاق واسع في الكشف عن المتغيرات المسببة للأمراض في الجينوم.
كما تم استخدام تقنية WES في اعتلال عضلة القلب الموروث لتحديد المتغيرات المسببة للأمراض لزيادة توضيح المسببات. تشير الأدلة الناشئة إلى أن الجينات التي تشفر طفرات جينات البروتين الهيكلي للساركومير ، مثل MYH7 10 و MYH6 11 و MYBPC3 12 و MYL2 13 و MYL314 و TNNT2 15 و TNNI3 16 و TNNC1 17 وTPM1 18 مسؤولة عن المسببات الوراثية ل HCM. الوعي بالمتغيرات المسببة للأمراض في الجينات النادرة المسببة للأمراض (على سبيل المثال ، الغموض ، الكالمودولين الهيكلي الخلوي و RhoGEF المتفاعل مع التيتان (OBSCN ، OMIM: 608616) 19 ، التمثيل ألفا 2 (ACTN2 ، OMIM: 102573) 20 ، والسيستين والبروتين الغني بالجليكاين 3 (CSRP3 ، OMIM: 600824) 21) ارتبط أيضا ب HCM. حددت الدراسات الجينية الحالية العديد من المتغيرات المسببة للأمراض المتميزة في جين البروتين الساركوميري في حوالي 40٪ -60٪ من مرضى HCM ، وكشفت الاختبارات الجينية في مرضى HCM أن معظم المتغيرات المسببة للأمراض تحدث في سلسلة الميوسين الثقيلة (MYH7) والبروتين C المرتبط بالميوسين (MYBPC3). ومع ذلك ، فإن الأساس الجيني ل HCM لا يزال بعيد المنال. لا يزال استكشاف إمراضية هذه الاختلافات التي تكمن وراء مرضى HCM من البشر يمثل تحديا كبيرا22.
في هذه الدراسة ، أبلغنا عن متغير ممرض في MYH7 في عائلة هان صينية مع HCM بواسطة WES. من أجل التحقق من إمراضية هذا البديل ، أنشأنا فئران C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) باستخدام نظام CRISPR / Cas9. نناقش أيضا الآليات المعقولة لهذا البديل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، وصفنا إحدى عائلات الهان الصينية المصابة ب HCM. كشف التحليل الوراثي أن طفرة MYH6 غير المتجانسة p.G823E تفصل مع المرض في أفراد الأسرة الذين يعانون من الوراثة الجسدية السائدة. للتحقق من صحة إمراضية طفرة G823E ومناقشة الآليات الأساسية ، أنشأنا نموذج ماوس C57BL / 6N مع G823E في موضع الماوس Myh7 ب?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال مشروع صندوق البحوث الطبية لمقاطعة قوانغدونغ (A2022363) والمشروع الرئيسي للجنة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا ، الصين (منحة رقم 2022).
نود أن نشكر Qingjian Chen من جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك على المساعدة أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
Riferimenti
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
