Étude de la pathogenèse de la mutation MYH7 Gly823Glu dans la cardiomyopathie hypertrophique familiale à l’aide d’un modèle murin
Summary
Sur la base de la famille de cardiomyopathie héréditaire familiale trouvée dans notre travail clinique, nous avons créé un modèle murin C57BL / 6N avec une mutation ponctuelle (G823E) au locus MYH7 de la souris grâce à l’ingénierie du génome médiée par CRISPR / Cas9 pour vérifier cette mutation.
Abstract
La cardiomyopathie hypertrophique familiale (HCM, OMIM: 613690) est la cardiomyopathie la plus courante en Chine. Cependant, l’étiologie génétique sous-jacente de la CMH reste insaisissable.
Nous avons précédemment identifié une variante hétérozygote du gène de la chaîne lourde 7 de la myosine (MYH7), NM_000257.4 : c.G2468A (p.G823E), dans une grande famille chinoise Han atteinte de CMH. Dans cette famille, la variante G823E coségrége avec un trouble autosomique dominant. Cette variante est située dans le domaine du bras de levier de la région du cou de la protéine MYH7 et est hautement conservée parmi les myosines homologues et les espèces. Pour vérifier la pathogénicité de la variante G823E, nous avons produit un modèle murin C57BL/6N avec une mutation ponctuelle (G823E) au locus MYH7 de la souris avec ingénierie génomique médiée par CRISPR/Cas9. Nous avons conçu des vecteurs de ciblage d’ARNg et des oligonucléotides donneurs (avec des séquences de ciblage flanquées de 134 pb d’homologie). Le site p.G823E (GGG à GAG) dans l’oligonucléotide donneur a été introduit dans l’exon 23 de MYH7 par réparation dirigée par homologie. Un p.R819 silencieux (AGG à CGA) a également été inséré pour empêcher la liaison à l’ARNg et le reclivage de la séquence après réparation dirigée par homologie. L’échocardiographie a révélé une hypertrophie de la paroi postérieure ventriculaire gauche (LVPW) avec systole chez des souris MYH7 G823E/- à l’âge de 2 mois. Ces résultats ont également été validés par analyse histologique (Figure 3).
Ces résultats démontrent que le variant G823E joue un rôle important dans la pathogenèse de la CMH. Nos résultats enrichissent le spectre des variantes de MYH7 liées à la CMH familiale et peuvent fournir des conseils pour le conseil génétique et le diagnostic prénatal dans cette famille chinoise.
Introduction
La cardiomyopathie hypertrophique (HCM, OMIM: 613690) est la cardiomyopathie la plus courante en Chine, avec une incidence estimée à 0,2%, affectant 150 000 personnes 1,2.
La caractéristique anatomique pathologique qui caractérise la CMH est l’hypertrophie ventriculaire asymétrique, qui implique souvent le tractus d’écoulement ventriculaire et / ou le septum interventriculaire3. La manifestation clinique est une dyspnée à l’effort, de la fatigue et des douleurs thoraciques. Le phénotype individuel de la CMH présente une variabilité allant d’une insuffisance cardiaque cliniquement insidieuse à une insuffisance cardiaque sévère. Les patients atteints de CMH ont besoin d’un traitement médical, d’une transplantation cardiaque, d’un équipement de maintien des fonctions vitales et d’un suivi multidisciplinaire4.
Au cours du siècle dernier, la technologie PCR a changé la façon dont nous étudions l’ADN5. Une méthode de séquençage de l’ADN pour le diagnostic clinique a été découverte par Sanger et ses collègues6. La technique de Sanger a ensuite été appliquée au projet du génome humain, mais cette approche était coûteuse et prenait beaucoupde temps 7. L’avènement du séquençage du génome entier (WGS) a porté les connaissances sur les maladies génétiques humaines à de nouveaux sommets, mais il est resté prohibitif en termes de coût. La technologie de séquençage de l’exome entier (WES) est utilisée depuis longtemps pour détecter les variantes de la lignée germinale8 et a réussi à identifier les mutations somatiques conductrices dans l’exome de divers cancers9. La détection d’exons d’ADN ou de régions codantes par WES peut être utilisée pour révéler des variantes pathogènes dans la plupart des maladies mendéliennes. Aujourd’hui, avec la diminution du coût du séquençage, le séquençage pangénomique devrait devenir un outil important dans la recherche en génomique et peut être largement utilisé dans la détection de variantes pathogènes dans le génome.
La technologie WES a également été utilisée dans la cardiomyopathie héréditaire pour identifier les variantes pathogènes afin d’élucider davantage l’étiologie. De nouvelles preuves ont impliqué que les gènes codant pour les mutations des gènes de la protéine structurelle du sarcomère, tels que MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 etTPM1 18 sont responsables de l’étiologie génétique de la CMH. La connaissance des variantes pathogènes dans les gènes pathogènes (p. ex. obscurine, calmoduline cytosquelettique et RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, alpha 2 agissant (ACTN2, OMIM: 102573)20 et cystéine et protéine riche en glycine 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) a également été associée à la CMH. Les études génétiques actuelles ont identifié plusieurs variantes pathogènes distinctes dans le gène de la protéine sarcomérique chez environ 40% à 60% des patients atteints de CMH, et les tests génétiques chez les patients atteints de CMH ont révélé que la plupart des variantes pathogènes se produisent dans la chaîne lourde de myosine (MYH7) et la protéine C liant la myosine (MYBPC3). Cependant, la base génétique de la CMH reste insaisissable. Explorer la pathogénicité de ces variations qui sous-tendent les patients humains atteints de CMH reste un défi majeur22.
Dans cette étude, nous rapportons une variante pathogène de MYH7 dans une famille Han chinoise atteinte de CMH par WES. Afin de vérifier la pathogénicité de cette variante, nous avons établi une souris knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) en utilisant le système CRISPR / Cas9. Nous discutons également des mécanismes plausibles de cette variante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous décrivons une famille chinoise Han atteinte de CMH. L’analyse génétique a révélé qu’une mutation hétérozygote MYH6 p.G823E co-ségrége avec la maladie chez les membres de la famille ayant une transmission autosomique dominante. Pour valider la pathogénicité de la mutation G823E et discuter des mécanismes sous-jacents, nous avons créé un modèle murin C57BL/6N avec G823E au locus Myh7 de souris par ingénierie génomique médiée par CRISPR/Cas9.
Les ca…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet du Fonds de recherche médicale de la province du Guangdong (A2022363) et le projet majeur du Comité de la science et de la technologie du Guangdong, Chine (subvention n ° 2022).
Nous tenons à remercier Qingjian Chen de l’Université du Maryland, College Park, pour l’aide lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
Riferimenti
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
