Undersöka patogenesen av MYH7-mutation Gly823Glu i familjär hypertrofisk kardiomyopati med hjälp av en musmodell
Summary
Baserat på den familjära ärftliga kardiomyopatifamiljen som finns i vårt kliniska arbete skapade vi en C57BL/6N-musmodell med en punktmutation (G823E) vid musens MYH7-locus genom CRISPR/Cas9-medierad genomteknik för att verifiera denna mutation.
Abstract
Familjär hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) är den vanligaste kardiomyopatin i Kina. Den underliggande genetiska etiologin för HCM förblir dock svårfångad.
Vi har tidigare identifierat en myosin tung kedja 7 (MYH7) gen heterozygot variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), i en stor kinesisk Han-familj med HCM. I denna familj kosegregerar variant G823E med en autosomal dominerande sjukdom. Denna variant är belägen i hävarmdomänen i nackregionen av MYH7-proteinet och är mycket bevarad bland homologa myosiner och arter. För att verifiera patogeniciteten hos G823E-varianten tog vi fram en C57BL/6N-musmodell med en punktmutation (G823E) vid musens MYH7-locus med CRISPR/Cas9-medierad genomteknik. Vi designade gRNA-inriktningsvektorer och donatoroligonukleotider (med inriktningssekvenser flankerade av 134 bp homologi). Platsen p.G823E (GGG till GAG) i donatoroligonukleotiden introducerades i exon 23 av MYH7 genom homologistyrd reparation. En ljuddämpad p.R819 (AGG till CGA) sattes också in för att förhindra gRNA-bindning och omklyvning av sekvensen efter homologistyrd reparation. Ekokardiografi avslöjade vänster ventrikulär bakre vägg (LVPW) hypertrofi med systol i MYH7 G823E /- möss vid 2 månaders ålder. Dessa resultat validerades också genom histologisk analys (figur 3).
Dessa resultat visar att G823E-varianten spelar en viktig roll i patogenesen av HCM. Våra resultat berikar spektrumet av MYH7-varianter kopplade till familjär HCM och kan ge vägledning för genetisk rådgivning och fosterdiagnostik i denna kinesiska familj.
Introduction
Hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) är den vanligaste kardiomyopatin i Kina, med en uppskattad förekomst på 0,2%, vilket påverkar 150 000 personer 1,2.
Den patologiska anatomiska egenskapen som kännetecknar HCM är asymmetrisk ventrikulär hypertrofi, som ofta involverar det ventrikulära utflödeskanalen och / eller interventrikulärt septum3. Den kliniska manifestationen är ansträngningsdyspné, trötthet och bröstsmärta. Den individuella fenotypen av HCM har variationer som sträcker sig från kliniskt lömska till svår hjärtsvikt. Patienter med HCM behöver medicinsk behandling, hjärttransplantation, livsuppehållande utrustning och tvärvetenskaplig uppföljning4.
Under det senaste århundradet har PCR-tekniken förändrat hur vi studerar DNA5. En DNA-sekvenseringsmetod för klinisk diagnos upptäcktes av Sanger och kollegor6. Sanger-tekniken tillämpades därefter på Human Genome Project, men detta tillvägagångssätt var kostsamt och tidskrävande7. Tillkomsten av helgenomsekvensering (WGS) förde insikter om mänsklig genetisk sjukdom till nya höjder, men det förblev oöverkomligt när det gäller kostnad. Whole-exome sequencing (WES) -teknik har länge använts för att upptäcka bakterievarianter8 och har lyckats identifiera somatiska drivmutationer i exom av olika cancerformer9. Detekteringen av DNA-exoner eller kodande regioner av WES kan användas för att avslöja patogena varianter i de flesta mendeliska sjukdomar. Idag, med de minskande kostnaderna för sekvensering, förväntas WGS bli ett viktigt verktyg inom genomikforskning och kan användas i stor utsträckning för att upptäcka patogena varianter i genomet.
WES-teknik har också använts i ärftlig kardiomyopati för att identifiera patogena varianter för att ytterligare belysa etiologin. Nya bevis har implicerat att gener som kodar för sarkomerstrukturella proteingenmutationer, såsom MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ochTPM1 18 är ansvariga för HCM: s genetiska etiologi. Medvetenhet om patogena varianter i sällsynta sjukdomsframkallande gener (t.ex. obscurin, cytoskeletal calmodulin och titin-interagerande RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, verkande alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 och cystein- och glycinrikt protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) har också associerats med HCM. Nuvarande genetiska studier har identifierat flera distinkta patogena varianter i den sarkomeriska proteingenen hos cirka 40%-60% av HCM-patienterna, och genetisk testning hos HCM-patienter avslöjade att de flesta patogena varianter förekommer i myosin-tungkedjan (MYH7) och myosinbindande protein C (MYBPC3). Den genetiska grunden för HCM är dock fortfarande svårfångad. Att utforska patogeniciteten hos dessa variationer som ligger till grund för de mänskliga HCM-patienterna är fortfarande en stor utmaning22.
I denna studie rapporterar vi en patogen variant i MYH7 i en kinesisk Han-familj med HCM av WES. För att verifiera patogeniteten hos denna variant etablerade vi en C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmöss med CRISPR / Cas9-systemet. Vi diskuterar också troliga mekanismer för denna variant.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie beskriver vi en kinesisk Han-familj med HCM. Genetisk analys avslöjade att en heterozygot MYH6-mutation p.G823E samsegregerar med sjukdomen hos familjemedlemmar med autosomalt dominerande arv. För att validera patogeniciteten hos G823E-mutationen och diskutera de underliggande mekanismerna skapade vi en C57BL/6N-musmodell med G823E vid mus Myh7-locus av CRISPR/Cas9-medierad genomteknik.
Fenotypiska egenskaper hos C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss utvärderades ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av projektet Medical Research Fund i Guangdong-provinsen (A2022363) och det stora projektet från Guangdong-kommittén för vetenskap och teknik, Kina (bidrag nr.2022).
Vi vill tacka Qingjian Chen från University of Maryland, College Park för hjälpen under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
Riferimenti
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
