Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım
Summary
AlPcS2a aracılı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerde hücre içi veziküllerin (IV’ler) uzaysal zamansal hasarını incelemek için güçlü bir araçtır.
Abstract
Hücre içi veziküller (IV’ler), veziküllerin sitoplazmaya endositozu ile oluşur. IV oluşumu, IV membranlarının geçirgenliği ve endozom ve lizozomların oluşumu yoluyla çeşitli sinyal yolaklarının aktive edilmesinde rol oynar. IV’lerin oluşumunu ve IV regülasyonunu kontrol etmedeki materyalleri incelemek için kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI) adı verilen bir yöntem uygulanır. CALI, membran geçirgenliği tarafından indüklenen sinyal yolunu incelemek için görüntüleme tabanlı bir fotodinamik metodolojidir. Yöntem, seçilen organelin mekansal zamansal manipülasyonunun bir hücrede geçirgenleştirilmesine izin verir. CALI yöntemi, endozomların ve lizozomların geçirgenliği yoluyla spesifik molekülleri gözlemlemek ve izlemek için uygulanmıştır. IV’lerin membran rüptürünün, galektin-3 gibi glikan bağlayıcı proteinleri seçici olarak işe aldığı bilinmektedir. Burada, protokol, IV rüptürünün AlPcS2a tarafından indüklenmesini ve bozulmuş lizozomları etiketlemek için bir belirteç olarak galektin-3’ün kullanılmasını açıklar; bu, IV membran rüptürünün aşağı akış etkilerini ve çeşitli durumlar altında aşağı akış etkilerini incelemede yararlıdır.
Introduction
Bir tür hücre içi vezikül (IV) olan endozomlar, endositoz tarafından oluşturulur ve daha sonra lizozomlara olgunlaşır. IV’lerin oluşumunda çeşitli hücre içi sinyal yolları rol oynar; Ek olarak, farklı içsel ve dışsal uyaranlar IV’lere zarar verebilir (örneğin, patojenler enfeksiyon sırasında sınırlı zardan kaçabilir ve sitoplazma1’e girebilir). Buna genellikle endositotik veziküllerinrüptürü eşlik eder 2. Bu nedenle, IV’leri hedefleme ve zarar verme teknikleri ilgili çalışmalarda kullanılabilir3.
Fotodinamik terapi (PDT), tümörleri veya patojenleri öldürerek hastalıklarla mücadele etmek için ışığa bağımlı bir terapidir4. PDT’de, hedeflenen hücreler, ışık aydınlatmasıile lokal olarak aktive edilebilen fotosensitizörler adı verilen toksik olmayan kromoforlarla etiketlenir 5,6. Fotosensitizörler ışıktan enerjiyi emer ve uyarılmış bir singlet durumuna dönüşür ve uzun ömürlü uyarılmış üçlü duruma yol açar. Üçlü durumun fotosensitizörleri elektron veya enerji transferine uğrayabilir ve oksijen varlığında reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturabilir ve aydınlatma bölgesi7 içindeki etiketli hücreleri mekansal olarak yok edebilir. Sonuç, ışığın gücüne bağlı olarak değişir8. Fotosensitizörlerin konsantrasyonunu ve ışık aydınlatmasının yoğunluğunu kontrol ederek, hedeflenen biyomoleküller, kromofor yardımlı ışık inaktivasyonu (CALI)9 olarak adlandırılan hücre lizisi olmadan seçici olarak inaktive edilebilir. Çeşitli hücre altı hedefleri seçici olarak etiketleyebilen fotosensitizörlerin önemli ölçüde gelişmesiyle CALI, nükleotidler ve proteinler gibi küçük biyomoleküllerin yanı sıra mitokondri ve endo-lizozomlar 3,10,11,12,13 gibi organeller için biyomoleküllerin ışık aracılı inaktivasyonunu kontrol etmek için değerli bir araç haline gelmiştir.
CALI ile karşılaştırıldığında, lizozomal hasar için bakteriyel toksin 14,15 ve Leu-Leu-OMe16 tedavisi gibi membranları bozmak için kimyasal veya fiziksel yöntemler de kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler içindeki IV’lerin toplu bozulmasını gösterir. CALI’de sağlam fotosensitizörler (yani, Al(III) ftalosiyanin klorür disülfonik asit (AlPcS2a)) kullanılır; Endositoz yoluyla lizozomları hedef alan AlPcS2a, kontrollü bir bölgede endozomları veya lizozomları parçalamak için kullanılır17. AlPcS2a, plazma zarındaki lipitlere bağlanan ve endositoz yoluyla içselleştirilen ve sonunda endositik yol18 aracılığıyla lizozom içinde biriken hücre zarı geçirimsiz ftalosiyanin bazlı bir kromofordur. Yakın kızılötesi spektral bir bölgedeki ışığı emer ve uyarılmış AlPcS2a 18 tarafından üretilen büyük bir ROS olan singlet oksijen üretir. Singlet oksijeninin hızla bozunması, hücrelerdeki küçük bir bölgede (yaklaşık 10-20 nm) difüzyon ve reaksiyon mesafesini sınırlar19. AlPcS2a inkübasyon ve ışık aydınlatmasının süresini ayarlayarak, IV’lerin hücre altı bir alandaki hasarının mekansal zamansal kontrolüne izin verilir. Bu nedenle CALI, IV hasarının sonuçlarını ve IV’lerin oluşumunu ve düzenlenmesini incelemek için güçlü bir araç haline gelir.
Bu çalışmada, AlPcS2a’yı fotosensitizör olarak kullanan spesifik bir CALI protokolü ele alınmıştır. Bu protokol, endozomlar ve lizozomlar da dahil olmak üzere çeşitli IV tiplerine uygulanabilir ve membran rüptürü sonrası takip yanıtlarını incelemek için kullanılabilir. Lizozom rüptüründen sonra ortaya çıkan florofor konjuge galektin-316,20 eksprese eden HeLa hücreleri bu protokolü göstermek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a plazma zarına bağlanır, daha sonra endositoz tarafından içselleştirilir ve sonunda lizozomlarda birikir. AlPcS2a böylece inkübasyon süresini ayarlayarak hücre altı bölmelerde lokalize edilebilir. Bu metodolojinin bir sınırlaması, IV’lerin sadece bir alt popülasyonunun AlPcS2a tarafından endositoz yoluyla etiketlenebilmesidir, çünkü ER ve Golgi aparatı gibi IV’lerin başka birçok membran kaynağı vardır. Ek olarak, AlPcS2a’nın erken veya geç end…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, araştırma desteği için IBMS, Academia Sinica Inflammation Core Facility’ye teşekkür etmek istiyor. Çekirdek tesis, Academia Sinica Çekirdek Tesisi ve Yenilikçi Enstrüman Projesi (AS-CFII-111-213) tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, görüntü edinimine yardımcı oldukları için Biyomedikal Bilimler Enstitüsü (IBMS), Academia Sinica (AS) Ortak Ekipman Çekirdek Tesisi’ne teşekkür eder.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
Riferimenti
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972 (2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Ricerca sul cancro. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
