Uma abordagem fotodinâmica no estudo da função da ruptura de vesículas intracelulares

Summary

A inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) mediada por AlPcS_2a é uma ferramenta poderosa para estudar danos espaço-temporais de vesículas intracelulares (IVs) em células vivas.

Abstract

As vesículas intracelulares (IVs) são formadas através da endocitose das vesículas no citoplasma. A formação IV está envolvida na ativação de várias vias de sinal através da permeabilização das membranas IV e da formação de endossomos e lisossomos. Um método denominado inativação a laser assistida por cromóforos (CALI) é aplicado para estudar a formação de IVs e os materiais no controle da regulação de IV. CALI é uma metodologia fotodinâmica baseada em imagens para estudar a via de sinalização induzida pela permeabilização da membrana. O método permite a manipulação espaço-temporal da organela selecionada para ser permeabilizada em uma célula. O método CALI tem sido aplicado para observar e monitorar moléculas específicas através da permeabilização de endossomos e lisossomos. Sabe-se que a ruptura da membrana dos IVs recruta seletivamente proteínas ligadoras de glicanos, como a galectina-3. Aqui, o protocolo descreve a indução de ruptura IV por AlPcS_2a e o uso de galectina-3 como marcador para marcar lisossomos comprometidos, o que é útil no estudo dos efeitos a jusante da ruptura da membrana IV e seus efeitos a jusante em várias situações.

Introduction

Os endossomos, um tipo de vesícula intracelular (IV), são formados pela endocitose e depois amadurecem em lisossomos. Várias vias de sinal intracelular estão envolvidas na formação de IVs; além disso, diferentes estímulos intrínsecos e extrínsecos podem danificar IVs (por exemplo, patógenos podem escapar da membrana limitada durante a infecção e entrar no citoplasma¹). Geralmente é acompanhada de ruptura de vesículas endocitóticas². Portanto, as técnicas de direcionamento e lesão de IVs podem ser utilizadas em estudos^{relacionados3}.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia fotodependente para combater doenças matando tumores ou patógenos⁴. Na TFD, as células-alvo são marcadas com cromóforos atóxicos, denominados fotossensibilizadores, que podem ser ativados localmente pela iluminação luminosa ^5,6. Os fotossensibilizadores absorvem a energia da luz e se transformam em um estado singlete excitado, levando ao estado trigêmeo excitado de longa duração. Os fotossensibilizadores do estado triplete podem sofrer transferência eletrônica ou de energia e formar espécies reativas de oxigênio (EROs) na presença de oxigênio, podendo destruir espacialmente células marcadas dentro da região de iluminação⁷. A consequência varia de acordo com a potência da luz⁸. Controlando a concentração de fotossensibilizadores e a intensidade da iluminação luminosa, biomoléculas alvo podem ser seletivamente inativadas sem lise celular, denominada inativação luminosa assistida por cromóforos (CALI)⁹. Com o significativo desenvolvimento de fotossensibilizadores que podem marcar seletivamente vários alvos subcelulares, o CALI tornou-se uma ferramenta valiosa para controlar a inativação mediada pela luz de biomoléculas para pequenas biomoléculas, como nucleotídeos e proteínas, bem como organelas, como mitocôndrias e endolisossomos3,10,11,12,13.

Comparado ao CALI, métodos químicos ou físicos também são utilizados para prejudicar as membranas, como a toxina bacteriana ^14,15 e o tratamento com Leu-Leu-OMe¹⁶ para danos lisossômicos. No entanto, esses métodos mostram comprometimento em massa de IVs dentro das células. Fotossensibilizadores robustos (i.e., ácido dissulfônico de cloreto de ftalocianina Al(III) (AlPcS_2a)) são usados em CALI; O AlPcS_2a, que tem como alvo os lisossomos através da endocitose, é usado para romper endossomos ou lisossomos em uma região controlada¹⁷. AlPcS_2a é um cromóforo à base de ftalocianina impermeável à membrana celular que se liga a lipídios na membrana plasmática e é internalizado através de endocitose e eventualmente se acumula dentro do lisossomo através da via endocítica¹⁸. Ele absorve luz dentro de uma região espectral no infravermelho próximo e gera oxigênio singlete, uma das principais ROS geradas pelo AlPcS_2a¹⁸ excitado. O decaimento do oxigênio singlete limita rapidamente sua difusão e distância de reação dentro de uma minúscula região das células (aproximadamente 10-20 nm)¹⁹. Ao ajustar a duração da incubação do AlPcS_2a e a iluminação da luz, é permitido o controle espaço-temporal do dano de IVs dentro de uma área subcelular. O CALI torna-se, portanto, uma ferramenta poderosa para examinar as consequências dos danos IV, e a formação e regulação dos IVs.

Neste estudo, um protocolo específico de CALI usando AlPcS_2a como fotossensibilizador é abordado. Este protocolo pode ser aplicado a vários tipos de IVs, incluindo endossomos e lisossomos, e usado para examinar as respostas de seguimento após a ruptura da membrana. Células HeLa expressando galectina-3 conjugada com fluoróforo^16,20 reveladas após ruptura do lisossomo são utilizadas para demonstrar este protocolo.

Protocol

1. Preparação de estoque AlPcS2a Dissolver 10 mg de AlPcS2a em 400 μL de NaOH 0,1 M. Para melhorar a solubilidade, aqueça a solução a 50 °C e vórtice. Misturar a solução com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, filtrar a solução com um filtro de 0,22 μm para remover os precipitados insolúveis. Medir a concentração da solução através de um espectrofotômetro UV-Vis. O coeficiente de extinção de AlPcS…

Representative Results

Uma figura esquemática representando o dano IV induzido por AlPcS2a, incluindo endossomo e lisossomo, foi mostrada (Figura 1). Marcadores disponíveis comercialmente podem ser usados para determinar as condições de coloração de AlPcS2a . Por exemplo, a colocalização de AlPcS2a puncta e corante verdefluorescente 22 (Figura 2). A galectina-3 marc…

Discussion

AlPcS_2a liga-se à membrana plasmática, em seguida, é internalizado por endocitose e eventualmente se acumula em lisossomos. AlPcS_2a pode, assim, ser localizado nos compartimentos subcelulares ajustando a duração da incubação. Uma limitação dessa metodologia é que apenas uma subpopulação de IVs poderia ser marcada por AlPcS_2a através de endocitose, pois existem muitas outras fontes de IV de membrana, como RE e aparelho de Golgi. Além disso, a marcação seletiva de AlPcS_…

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1