В этом протоколе представлены и описаны этапы выделения, рассечения, культивирования и окрашивания эксплантов сетчатки, полученных от взрослой мыши. Этот метод полезен в качестве модели ex vivo для изучения различных нейрососудистых заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия.
Одной из проблем в исследованиях сетчатки является изучение перекрестных помех между различными клетками сетчатки, такими как нейроны сетчатки, глиальные клетки и сосудистые клетки. Выделение, культивирование и поддержание нейронов сетчатки in vitro имеют технические и биологические ограничения. Культивирование эксплантов сетчатки может преодолеть эти ограничения и предложить уникальную модель ex vivo для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки с хорошо контролируемыми биохимическими параметрами и независимо от сосудистой системы. Кроме того, экспланты сетчатки являются эффективным инструментом скрининга для изучения новых фармакологических вмешательств при различных сосудистых и нейродегенеративных заболеваниях сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия. Здесь мы опишем подробный протокол изоляции и культуры эксплантов сетчатки в течение длительного периода. В рукописи также представлены некоторые технические проблемы во время этой процедуры, которые могут повлиять на желаемые результаты и воспроизводимость культуры эксплантата сетчатки. Иммуноокрашивание сосудов сетчатки, глиальных клеток и нейронов продемонстрировало интактные капилляры сетчатки и нейроглиальные клетки через 2 недели с начала культуры эксплантата сетчатки. Это делает экспланты сетчатки надежным инструментом для изучения изменений в сосудистой системе сетчатки и нейроглиальных клетках в условиях, имитирующих заболевания сетчатки, такие как диабетическая ретинопатия.
Для изучения заболеваний сетчатки были представлены различные модели, включая модели in vivo и in vitro. Использование животных в исследованиях по-прежнему является предметом непрерывных этических и трансляционных дебатов1. Животные модели с участием грызунов, таких как мыши или крысы, обычно используются в исследованиях сетчатки 2,3,4. Тем не менее, клинические проблемы возникли из-за различных физиологических функций сетчатки у грызунов по сравнению с людьми, таких как отсутствие макулы или различия в цветовом зрении5. Использование посмертных глаз человека для исследований сетчатки также имеет много проблем, включая, но не ограничиваясь, различиями в генетическом фоне оригинальных образцов, истории болезни доноров и предыдущей среде или образе жизни доноров6. Кроме того, использование моделей in vitro в исследованиях сетчатки также имеет некоторые недостатки. Модели клеточных культур, используемые для изучения заболеваний сетчатки, включают использование клеточных линий человеческого происхождения, первичных клеток или стволовых клеток7. Было показано, что используемые модели клеточных культур имеют проблемы с точки зрения загрязнения, неправильной идентификации или дедифференцированности 8,9,10,11. В последнее время органоидная технология сетчатки показала значительный прогресс. Однако построение очень сложных сетчаток in vitro имеет ряд ограничений. Например, органоиды сетчатки не имеют тех же физиологических и биохимических характеристик, что и зрелые сетчатки in vivo. Чтобы преодолеть это ограничение, органоидная технология сетчатки должна интегрировать больше биологических и клеточных особенностей, включая гладкомышечные клетки, сосудистую систему и иммунные клетки, такие как микроглия 12,13,14,15.
Органотипические экспланты сетчатки стали надежным инструментом для изучения таких заболеваний сетчатки, как диабетическая ретинопатия и дегенеративные заболевания сетчатки 16,17,18,19. По сравнению с другими существующими методами, использование эксплантов сетчатки поддерживает как культуры клеток сетчатки in vitro, так и современные модели животных in vivo, добавляя уникальную особенность для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки при одних и тех же биохимических параметрах и независимо от системных переменных. Экстраплантные культуры позволяют различным клеткам сетчатки храниться вместе в одной среде, что позволяет сохранить межклеточные взаимодействия сетчатки 20,21,22. Более того, предыдущее исследование показало, что экспланты сетчатки способны сохранять морфологическую структуру и функциональность культивируемых клеток сетчатки23. Таким образом, экспланты сетчатки могут обеспечить достойную платформу для исследования возможных терапевтических целей для широкого спектра заболеваний сетчатки 24,25,26. Экстраплантные культуры сетчатки обеспечивают контролируемую технику и являются очень гибкой заменой существующим мотылькам, которые позволяют проводить многочисленные фармакологические манипуляции и могут раскрыть несколько молекулярных механизмов27.
Общая цель данной работы состоит в том, чтобы представить метод эксплантации сетчатки в качестве разумной промежуточной модельной системы между клеточными культурами in vitro и моделями животных in vivo . Этот метод может имитировать функции сетчатки лучше, чем диссоциированные клетки. Поскольку различные слои сетчатки остаются нетронутыми, межклеточные взаимодействия сетчатки могут быть оценены в лаборатории в хорошо контролируемых биохимических условиях и независимо от функционирования сосудистой системы28.
Наша лаборатория изучает патофизиологические изменения, которые способствуют микрососудистой дисфункции сетчатки в течение 31,32,33,34,35,36 лет. Экспланты сетчатки являются одним из…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Грант Национального института здравоохранения (NIH) Для Национального института глаз (R01 EY030054) д-ру Мохамеду Аль-Шабрави. Мы хотели бы поблагодарить Кэти Волосевич за помощь в видео-повествовании. Мы хотели бы поблагодарить доктора Кена Миттона из педиатрической исследовательской лаборатории сетчатки Института глаз Оклендского университета за его помощь во время использования хирургического микроскопа и записи. Это видео было смонтировано и срежиссировано доктором Халедом Эльмасри.
Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |