Эксплантация сетчатки взрослой мыши как модель Ex Vivo для изучения нейрососудистых заболеваний сетчатки

Summary

В этом протоколе представлены и описаны этапы выделения, рассечения, культивирования и окрашивания эксплантов сетчатки, полученных от взрослой мыши. Этот метод полезен в качестве модели ex vivo для изучения различных нейрососудистых заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия.

Abstract

Одной из проблем в исследованиях сетчатки является изучение перекрестных помех между различными клетками сетчатки, такими как нейроны сетчатки, глиальные клетки и сосудистые клетки. Выделение, культивирование и поддержание нейронов сетчатки in vitro имеют технические и биологические ограничения. Культивирование эксплантов сетчатки может преодолеть эти ограничения и предложить уникальную модель ex vivo для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки с хорошо контролируемыми биохимическими параметрами и независимо от сосудистой системы. Кроме того, экспланты сетчатки являются эффективным инструментом скрининга для изучения новых фармакологических вмешательств при различных сосудистых и нейродегенеративных заболеваниях сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия. Здесь мы опишем подробный протокол изоляции и культуры эксплантов сетчатки в течение длительного периода. В рукописи также представлены некоторые технические проблемы во время этой процедуры, которые могут повлиять на желаемые результаты и воспроизводимость культуры эксплантата сетчатки. Иммуноокрашивание сосудов сетчатки, глиальных клеток и нейронов продемонстрировало интактные капилляры сетчатки и нейроглиальные клетки через 2 недели с начала культуры эксплантата сетчатки. Это делает экспланты сетчатки надежным инструментом для изучения изменений в сосудистой системе сетчатки и нейроглиальных клетках в условиях, имитирующих заболевания сетчатки, такие как диабетическая ретинопатия.

Introduction

Для изучения заболеваний сетчатки были представлены различные модели, включая модели in vivo и in vitro. Использование животных в исследованиях по-прежнему является предметом непрерывных этических и трансляционных дебатов¹. Животные модели с участием грызунов, таких как мыши или крысы, обычно используются в исследованиях сетчатки ^2,3,4. Тем не менее, клинические проблемы возникли из-за различных физиологических функций сетчатки у грызунов по сравнению с людьми, таких как отсутствие макулы или различия в цветовом зрении⁵. Использование посмертных глаз человека для исследований сетчатки также имеет много проблем, включая, но не ограничиваясь, различиями в генетическом фоне оригинальных образцов, истории болезни доноров и предыдущей среде или образе жизни доноров⁶. Кроме того, использование моделей in vitro в исследованиях сетчатки также имеет некоторые недостатки. Модели клеточных культур, используемые для изучения заболеваний сетчатки, включают использование клеточных линий человеческого происхождения, первичных клеток или стволовых клеток⁷. Было показано, что используемые модели клеточных культур имеют проблемы с точки зрения загрязнения, неправильной идентификации или дедифференцированности 8,9,10,11. В последнее время органоидная технология сетчатки показала значительный прогресс. Однако построение очень сложных сетчаток in vitro имеет ряд ограничений. Например, органоиды сетчатки не имеют тех же физиологических и биохимических характеристик, что и зрелые сетчатки in vivo. Чтобы преодолеть это ограничение, органоидная технология сетчатки должна интегрировать больше биологических и клеточных особенностей, включая гладкомышечные клетки, сосудистую систему и иммунные клетки, такие как микроглия ^12,13,14,15.

Органотипические экспланты сетчатки стали надежным инструментом для изучения таких заболеваний сетчатки, как диабетическая ретинопатия и дегенеративные заболевания сетчатки 16,17,18,19. По сравнению с другими существующими методами, использование эксплантов сетчатки поддерживает как культуры клеток сетчатки in vitro, так и современные модели животных in vivo, добавляя уникальную особенность для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки при одних и тех же биохимических параметрах и независимо от системных переменных. Экстраплантные культуры позволяют различным клеткам сетчатки храниться вместе в одной среде, что позволяет сохранить межклеточные взаимодействия сетчатки 20,21,22. Более того, предыдущее исследование показало, что экспланты сетчатки способны сохранять морфологическую структуру и функциональность культивируемых клеток сетчатки²³. Таким образом, экспланты сетчатки могут обеспечить достойную платформу для исследования возможных терапевтических целей для широкого спектра заболеваний сетчатки 24,25,26. Экстраплантные культуры сетчатки обеспечивают контролируемую технику и являются очень гибкой заменой существующим мотылькам, которые позволяют проводить многочисленные фармакологические манипуляции и могут раскрыть несколько молекулярных механизмов²⁷.

Общая цель данной работы состоит в том, чтобы представить метод эксплантации сетчатки в качестве разумной промежуточной модельной системы между клеточными культурами in vitro и моделями животных in vivo . Этот метод может имитировать функции сетчатки лучше, чем диссоциированные клетки. Поскольку различные слои сетчатки остаются нетронутыми, межклеточные взаимодействия сетчатки могут быть оценены в лаборатории в хорошо контролируемых биохимических условиях и независимо от функционирования сосудистой системы²⁸.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Оклендском университете, Рочестер, штат Мичиган, США и соответствовали руководящим принципам, установленным Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и оф…

Representative Results

Выживание нейронных и сосудистых клеток сетчатки эксплантата сетчатки в культуральной среде ex vivo в течение длительного времениКультивируя эксплант сетчатки с использованием нашего протокола, мы успешно поддерживали различные клетки сетчатки, кото…

Discussion

Наша лаборатория изучает патофизиологические изменения, которые способствуют микрососудистой дисфункции сетчатки в течение 31,32,33,34,35,36 лет. Экспланты сетчатки являются одним из…

Materials

Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407