Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Summary

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Abstract

Um dos desafios na pesquisa da retina é estudar a conversa cruzada entre diferentes células da retina, como neurônios da retina, células gliais e células vasculares. Isolar, cultivar e sustentar neurônios da retina in vitro têm limitações técnicas e biológicas. A cultura de explantes de retina pode superar essas limitações e oferecer um modelo ex vivo único para estudar o cross-talk entre várias células da retina com parâmetros bioquímicos bem controlados e independentes do sistema vascular. Além disso, os explantes da retina são uma ferramenta de triagem eficaz para o estudo de novas intervenções farmacológicas em várias doenças vasculares e neurodegenerativas da retina, como a retinopatia diabética. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento e cultura de explantes da retina por um período prolongado. O manuscrito também apresenta alguns dos problemas técnicos durante este procedimento que podem afetar os resultados desejados e a reprodutibilidade da cultura de explante retinal. A imunocoloração dos vasos da retina, células gliais e neurônios demonstrou capilares da retina intactos e células neurogliais após 2 semanas do início da cultura do explante da retina. Isso estabelece explantes de retina como uma ferramenta confiável para estudar mudanças na vasculatura da retina e células neurogliais sob condições que imitam doenças da retina, como a retinopatia diabética.

Introduction

Diferentes modelos foram apresentados para estudar doenças da retina, incluindo modelos in vivo e in vitro. O uso de animais em pesquisa ainda é uma questão de contínuo debate ético e translacional¹. Modelos animais envolvendo roedores, como camundongos ou ratos, são comumente utilizados em pesquisas sobre retina ^2,3,4. No entanto, preocupações clínicas têm surgido devido às diferentes funções fisiológicas da retina em roedores em comparação com humanos, como a ausência de mácula ou diferenças na visão de cores⁵. O uso de olhos post-mortem humanos para pesquisa da retina também tem muitos problemas, incluindo, entre outros, diferenças nos antecedentes genéticos das amostras originais, no histórico médico dos doadores e nos ambientes ou estilos de vida anteriores dos doadores⁶. Além disso, o uso de modelos in vitro na pesquisa da retina também tem algumas desvantagens. Os modelos de cultura celular utilizados para estudar doenças da retina incluem a utilização de linhagens celulares de origem humana, células primárias ou células-tronco⁷. Os modelos de cultura celular utilizados têm demonstrado problemas em termos de contaminação, identificação incorreta ou desdiferenciação 8,9,10,11. Recentemente, a tecnologia organoide da retina mostrou um progresso significativo. No entanto, a construção de retinas altamente complexas in vitro tem várias limitações. Por exemplo, os organoides da retina não têm as mesmas características fisiológicas e bioquímicas que as retinas maduras in vivo. Para superar essa limitação, a tecnologia organoide da retina deve integrar mais características biológicas e celulares, incluindo células musculares lisas, vasculatura e células imunes como a micróglia^12,13,14,15.

Os explantes organotípicos da retina têm emergido como uma ferramenta confiável para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética e as doenças degenerativas da retina^16,17,18,19. Em comparação com outras técnicas existentes, o uso de explantes de retina suporta tanto culturas de células da retina in vitro quanto modelos animais in vivo atuais, adicionando uma característica única para estudar o cross-talk entre várias células da retina sob os mesmos parâmetros bioquímicos e independentes de variáveis sistêmicas. As culturas de explante permitem que diferentes células da retina sejam mantidas juntas no mesmo ambiente, permitindo a preservação das interações intercelulares da retina^20,21,22. Além disso, um estudo anterior mostrou que os explantes da retina foram capazes de preservar a estrutura morfológica e a funcionalidade das células da retina cultivadas²³. Assim, os explantes de retina podem fornecer uma plataforma decente para a investigação de possíveis alvos terapêuticos para uma ampla variedade de doenças da retina^24,25,26. As culturas de explante retiniano fornecem uma técnica controlável e são substitutas muito flexíveis dos mothods existentes que permitem inúmeras manipulações farmacológicas e podem descobrir vários mecanismos moleculares²⁷.

O objetivo geral deste trabalho é apresentar a técnica de explante retiniano como um sistema de modelo intermediário razoável entre culturas de células in vitro e modelos animais di vivo. Esta técnica pode imitar as funções da retina de uma maneira melhor do que as células dissociadas. Como várias camadas retinianas permanecem intactas, as interações intercelulares da retina podem ser avaliadas em laboratório sob condições bioquímicas bem controladas e independentes do funcionamento do sistema vascular²⁸.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Oakland University, Rochester, MI, EUA e seguiram as diretrizes estabelecidas pela Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual. 1. Preparação animal Mantenha os animais alojados sob uma temperatura constante em um ambiente controlado pela luz. As configurações de…

Representative Results

Sobrevivência das células neuronais e vasculares da retina do explante retiniano em meio de cultura ex vivo por um tempo prolongadoAo cultivar um explante de retina utilizando nosso protocolo, fomos bem-sucedidos em manter diferentes células da retina que eram viáveis por até 2 semanas. Para verificar a presença de diferentes células da retina, foi realizada coloração por imunofluorescência do explante retiniano utilizando um marcador de células n…

Discussion

Nosso laboratório vem estudando as alterações fisiopatológicas que promovem a disfunção microvascular da retina há anos 31,32,33,34,35,36. Os explantes de retina são uma das técnicas que podem ser de grande valia para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética ou doenças degenerativas da retina. T…

Materials

Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407