Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.
Um dos desafios na pesquisa da retina é estudar a conversa cruzada entre diferentes células da retina, como neurônios da retina, células gliais e células vasculares. Isolar, cultivar e sustentar neurônios da retina in vitro têm limitações técnicas e biológicas. A cultura de explantes de retina pode superar essas limitações e oferecer um modelo ex vivo único para estudar o cross-talk entre várias células da retina com parâmetros bioquímicos bem controlados e independentes do sistema vascular. Além disso, os explantes da retina são uma ferramenta de triagem eficaz para o estudo de novas intervenções farmacológicas em várias doenças vasculares e neurodegenerativas da retina, como a retinopatia diabética. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento e cultura de explantes da retina por um período prolongado. O manuscrito também apresenta alguns dos problemas técnicos durante este procedimento que podem afetar os resultados desejados e a reprodutibilidade da cultura de explante retinal. A imunocoloração dos vasos da retina, células gliais e neurônios demonstrou capilares da retina intactos e células neurogliais após 2 semanas do início da cultura do explante da retina. Isso estabelece explantes de retina como uma ferramenta confiável para estudar mudanças na vasculatura da retina e células neurogliais sob condições que imitam doenças da retina, como a retinopatia diabética.
Diferentes modelos foram apresentados para estudar doenças da retina, incluindo modelos in vivo e in vitro. O uso de animais em pesquisa ainda é uma questão de contínuo debate ético e translacional1. Modelos animais envolvendo roedores, como camundongos ou ratos, são comumente utilizados em pesquisas sobre retina 2,3,4. No entanto, preocupações clínicas têm surgido devido às diferentes funções fisiológicas da retina em roedores em comparação com humanos, como a ausência de mácula ou diferenças na visão de cores5. O uso de olhos post-mortem humanos para pesquisa da retina também tem muitos problemas, incluindo, entre outros, diferenças nos antecedentes genéticos das amostras originais, no histórico médico dos doadores e nos ambientes ou estilos de vida anteriores dos doadores6. Além disso, o uso de modelos in vitro na pesquisa da retina também tem algumas desvantagens. Os modelos de cultura celular utilizados para estudar doenças da retina incluem a utilização de linhagens celulares de origem humana, células primárias ou células-tronco7. Os modelos de cultura celular utilizados têm demonstrado problemas em termos de contaminação, identificação incorreta ou desdiferenciação 8,9,10,11. Recentemente, a tecnologia organoide da retina mostrou um progresso significativo. No entanto, a construção de retinas altamente complexas in vitro tem várias limitações. Por exemplo, os organoides da retina não têm as mesmas características fisiológicas e bioquímicas que as retinas maduras in vivo. Para superar essa limitação, a tecnologia organoide da retina deve integrar mais características biológicas e celulares, incluindo células musculares lisas, vasculatura e células imunes como a micróglia12,13,14,15.
Os explantes organotípicos da retina têm emergido como uma ferramenta confiável para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética e as doenças degenerativas da retina16,17,18,19. Em comparação com outras técnicas existentes, o uso de explantes de retina suporta tanto culturas de células da retina in vitro quanto modelos animais in vivo atuais, adicionando uma característica única para estudar o cross-talk entre várias células da retina sob os mesmos parâmetros bioquímicos e independentes de variáveis sistêmicas. As culturas de explante permitem que diferentes células da retina sejam mantidas juntas no mesmo ambiente, permitindo a preservação das interações intercelulares da retina20,21,22. Além disso, um estudo anterior mostrou que os explantes da retina foram capazes de preservar a estrutura morfológica e a funcionalidade das células da retina cultivadas23. Assim, os explantes de retina podem fornecer uma plataforma decente para a investigação de possíveis alvos terapêuticos para uma ampla variedade de doenças da retina24,25,26. As culturas de explante retiniano fornecem uma técnica controlável e são substitutas muito flexíveis dos mothods existentes que permitem inúmeras manipulações farmacológicas e podem descobrir vários mecanismos moleculares27.
O objetivo geral deste trabalho é apresentar a técnica de explante retiniano como um sistema de modelo intermediário razoável entre culturas de células in vitro e modelos animais di vivo. Esta técnica pode imitar as funções da retina de uma maneira melhor do que as células dissociadas. Como várias camadas retinianas permanecem intactas, as interações intercelulares da retina podem ser avaliadas em laboratório sob condições bioquímicas bem controladas e independentes do funcionamento do sistema vascular28.
Nosso laboratório vem estudando as alterações fisiopatológicas que promovem a disfunção microvascular da retina há anos 31,32,33,34,35,36. Os explantes de retina são uma das técnicas que podem ser de grande valia para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética ou doenças degenerativas da retina. T…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao National Institute of Health (NIH) Funding Grant ao National Eye Institute (R01 EY030054) ao Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Gostaríamos de agradecer a Kathy Wolosiewicz por nos ajudar com a narração em vídeo. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ken Mitton, do laboratório de Pesquisa da Retina Pediátrica do Eye Research Institute, da Oakland University, por sua ajuda durante o uso do microscópio cirúrgico e da gravação. Este vídeo foi editado e dirigido pelo Dr. Khaled Elmasry.
Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |