Fabricação de Microesferas Porosas Altamente Abertas (HOPMs) via Tecnologia Microfluídica

Summary

O presente protocolo descreve a fabricação de microesferas porosas altamente abertas (HOPMs) à base de poli(ácido lático-co-glicólico) através da tecnologia microfluídica fácil baseada em formulação de emulsão única. Essas microesferas têm aplicações potenciais em engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.

Abstract

Em comparação com andaimes a granel e injeção direta de células sozinhas, as unidades modulares injetáveis atraíram enorme interesse em reparar tecidos com defeito devido à conveniência na embalagem das células, melhor retenção de células e invasividade mínima. Além disso, a conformação porosa desses portadores de microescala poderia aumentar a troca de meios e melhorar o nível de nutrientes e suprimentos de oxigênio. O presente estudo ilustra a fabricação conveniente de microesferas porosas altamente abertas à base de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA-HOPMs) pela tecnologia microfluídica fácil para aplicações de entrega celular. Os PLGA-HOPMs monodispersos resultantes possuíam tamanhos de partículas de ~400 μm e poros abertos de ~50 μm com janelas interligadas. Resumidamente, as gotículas de óleo emulsionadas (solução PLGA em diclorometano, DCM), envoltas com a fase aquosa gelatinosa a 7,5% (p/v), foram introduzidas na solução aquosa de poli(álcool vinílico) (PVA) de fluxo contínuo a 1% (p/v) através do bocal coaxial na configuração microfluídica personalizada. Posteriormente, as microesferas foram submetidas a procedimentos de extração e liofilização com solvente, resultando na produção de HOPMs. Notavelmente, várias formulações (concentrações de PLGA e porogênio) e parâmetros de processamento (potência emulsificante, medidor de agulha e taxa de fluxo de fase dispersa) desempenham papéis cruciais nas qualidades e características dos HOPMs PLGA resultantes. Além disso, essas arquiteturas podem potencialmente encapsular várias outras pistas bioquímicas, como fatores de crescimento, para a descoberta prolongada de medicamentos e aplicações de regeneração de tecidos.

Introduction

Microesferas carregadas de células oferecem vantagens favoráveis, como maior capacidade de retenção celular in situ, entrega eficiente de células e subsequente capacidade de proliferação celular in vivo¹. Até o momento, inúmeras investigações foram apresentadas para o desenvolvimento de uma estrutura de andaimes bem-sucedida para suportar um ambiente propício para células para regeneração tecidual ou aplicações de triagem de drogas². No entanto, o ambiente de hipóxia é muitas vezes inevitável no interior devido ao fornecimento insuficiente de nutrientes/oxigênio e acúmulo de resíduos metabólicos³. Para superar esses problemas, microesferas (MPs) altamente porosas têm sido desenvolvidas utilizando diversos biomateriais ^4,5,6. Além disso, em cultura dinâmica, os andaimes sofrem de tensão de cisalhamento excessiva⁷, e o estado instável do meio de cultura pode quebrar a fidelidade dos PMs. Alternativamente, o poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) poderia ser usado para processar PMs com boa resistência mecânica para cultura dinâmica¹. Por exemplo, demonstramos a co-injeção de microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de PLGA carregados de mioblastos (C2C12) de camundongos e microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) para curar a perda muscular volumétrica, alcançando notável melhora da regeneração muscular esquelética in situ ⁸.

Notavelmente, os PMs são caracterizados por grandes áreas superficiais e altas porosidades, o que é de interesse específico para a adesão e crescimento celular para a entrega celular minimamente invasiva⁹. Diante desses aspectos, diversos materiais biocompatíveis têm sido empregados para a fabricação dos MPs^10,11. Esses PMs projetáveis cocultivados com células oferecem excelente aderência, considerável resistência mecânica e janelas altamente interconectadas, o que poderia melhorar a proliferação celular para reparar tecidos danificados¹². Nesse sentido, diversas tecnologias também têm sido desenvolvidas para fabricar esferas porosas^13,14. Por um lado, os PMs foram produzidos por meio de agentes formadores de gás, como o NH₄HCO₃, que foram contidos devido à insuficiente interconectividade^15,16,17. Por outro lado, os PMs foram tosquiados diretamente após a emulsificação, o que levou a PMs polidispersos¹⁸. No final, a tecnologia microfluídica de gotículas baseada na abordagem de modelagem de emulsão talvez seja um método eficiente para a construção de PMs, pois muitas vezes resulta em partículas de tamanho uniforme¹⁹. Notavelmente, os atributos morfológicos das microesferas muitas vezes dependem da qualidade das gotículas de emulsão geradas (ou seja, água em óleo, W/O ou óleo em água, O/W), o que pode afetar significativamente os atributos dos biomateriais²⁰. Vale a pena notar que a plataforma microfluídica pré-projetada pode ser aplicada para gerar as microfibras ou microesferas. Em um exemplo, Yu et al. demonstraram a produção de estruturas microfibrosas carregadas de células baseadas em plataformas microfluídicas baseadas em capilares, que poderiam ser usadas para montar redes celulares para imitar tecidos naturais²¹. Em outro caso, Ye et al. fabricaram microcápsulas de cristal fotônico pela replicação de molde de esferas de cristal coloidal de sílica por meio de tecnologias microfluídicas, o que poderia superar muitas limitações das técnicas atuais que requerem rotulagem complexa e aparelhos específicos²².

De fato, a lógica por trás da utilização dessa técnica se deve a várias vantagens, como ser fácil por natureza, não exigir equipamentos sofisticados e sua conveniência na síntese de PMs de tamanho uniforme para entrega celular e aplicações de medicina regenerativa. Neste contexto, com componentes pré-projetados de emulsão-modelagem, PMs com altas porosidades e interconectividade podem ser convenientemente obtidos a partir de um dispositivo microfluídico montado a partir de tubos de poli(cloreto de vinila) (PVC), um capilar de vidro e uma agulha. Uma emulsão-precursora de W/O é preparada homogeneizando uma solução aquosa de gelatina e uma solução orgânica de PLGA. Ao injetar seletivamente a porção aplicável da emulsão na plataforma microfluídica, os PMs com tamanhos de partículas uniformes e poros interconectados em toda a superfície para o interior são fabricados. O presente protocolo tem como objetivo fabricar os PLGA-HOPMs por emulsão-modelagem na plataforma microfluídica. Acredita-se que este protocolo permite a produção reprodutível de PLGA-HOPMs e será potencialmente aplicável em seus campos relacionados de engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.

Protocol

1. Preparação de soluções Preparar a solução-mãe de PVA com antecedência, aquecendo a solução de PVA em banho-maria a 80 °C e, subsequentemente, colocando-a no frigorífico a 4 °C. Arrefecer até à temperatura ambiente (RT) para utilização experimental. Preparar o precursor da emulsão adicionando a solução aquosa de gelatina (1 ml, 7,5%, p/v) à fase orgânica do PLGA (2 ml, 2%, p/v em diclorometano, DCM) (ver Tabela de Materiais).NOTA: Geralmen…

Representative Results

Com base em trabalhos anteriores que otimizaram os principais parâmetros1, o PLGA foi dissolvido no solvente DCM evaporado. A emulsão primária de W/O foi preparada por homogeneização com gelatina sob tratamento com sonda ultrassônica. A estrutura fluídica de co-fluxo personalizada foi montada de forma simplista, na qual uma seringa foi empregada para introduzir os fluxos constantemente. Além disso, foram realizados procedimentos de enxágue suficientes para eliminar o PVA e a gelatina das …

Discussion

Este artigo descreve uma estratégia eficiente para fabricar arquiteturas baseadas em PLGA, ou seja, os PLGA-HOPMs. Deve-se notar que várias etapas críticas devem ser tomadas com cuidado, incluindo evitar a volatilização do solvente do PLGA e o ajuste suave da potência ultra-sônica para a posição alvo durante a preparação da emulsão. Além disso, a saída líquida da seringa de 20 mL pode ser ajustada até certo ponto para resolver a separação de fases de precursores emulsionados. No entanto, uma limitação…

Materials

Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100