Tillverkning av mycket öppna porösa mikrosfärer (HUMM) via mikrofluidisk teknik

Summary

Detta protokoll beskriver tillverkningen av poly(mjölksyra-co-glykolsyra)-baserade mycket öppna porösa mikrosfärer (HUMM) via den enemulsionsformuleringsbaserade facila mikrofluidiska tekniken. Dessa mikrosfärer har potentiella tillämpningar inom vävnadsteknik och läkemedelsscreening.

Abstract

Jämfört med bulkställningar och direktinsprutning av celler ensam har de injicerbara modulära enheterna fått enormt intresse för att reparera felaktiga vävnader på grund av bekvämlighet i cellförpackningen, förbättrad cellretention och minimal invasivitet. Dessutom kan den porösa konformationen hos dessa mikroskalabärare förbättra medieutbytet och förbättra nivån på näringsämnen och syretillförsel. Den aktuella studien illustrerar den praktiska tillverkningen av poly(mjölksyra-co-glykolsyra)-baserade mycket öppna porösa mikrosfärer (PLGA-HOPM) genom den facila mikrofluidiska tekniken för cellleveransapplikationer. De resulterande monodisperserade PLGA-HOPM: erna hade partikelstorlekar på ~ 400 μm och öppna porer på ~ 50 μm med sammankopplade fönster. Kortfattat infördes de emulgerade oljedropparna (PLGA-lösning i diklormetan, DCM), inslagna med 7,5% (w / v) gelatinvattenfasen, i den 1% (w / v) kontinuerliga flytande poly (vinylalkohol) (PVA) vattenlösningen genom koaxialmunstycket i den anpassade mikrofluidiska installationen. Därefter utsattes mikrosfärerna för lösningsmedelsextraktion och lyofiliseringsförfaranden, vilket resulterade i produktion av HUMPM. I synnerhet spelar olika formuleringar (koncentrationer av PLGA och porogen) och bearbetningsparametrar (emulgeringskraft, nålmätare och flödeshastighet för dispergerad fas) avgörande roller i egenskaperna och egenskaperna hos de resulterande PLGA HOPM: erna. Dessutom kan dessa arkitekturer potentiellt kapsla in olika andra biokemiska ledtrådar, såsom tillväxtfaktorer, för utökad läkemedelsupptäckt och vävnadsregenereringsapplikationer.

Introduction

Cellbelastade mikrosfärer erbjuder gynnsamma fördelar, såsom förbättrad cellretentionskapacitet in situ, effektiv leverans av celler och efterföljande förmåga till cellproliferation in vivo¹. Hittills har många undersökningar lagts fram för att utveckla en framgångsrik byggnadsställningsstruktur för att stödja en gynnsam miljö för celler för vävnadsregenerering eller läkemedelsscreeningsapplikationer². Hypoximiljön är dock ofta oundviklig i interiören på grund av otillräcklig tillförsel av näringsämnen / syre och ansamling av metaboliskt avfall³. För att övervinna dessa problem har mycket porösa mikrosfärer (PM) utvecklats med hjälp av olika biomaterial ^4,5,6. I dynamisk kultur lider ställningarna dessutom av överdriven skjuvspänning⁷, och odlingsmediets instabila tillstånd kan bryta troheten hos PM. Alternativt kan poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) användas för att bearbeta PM med god mekanisk hållfasthet för dynamisk kultur¹. Till exempel demonstrerade vi saminjektion av musmyoblast (C2C12) -laddad PLGA mycket öppna PM (HOPM) och humana navelvenendotelceller (HUVEC) -laddade poly (etylenglykol) ihåliga mikroroder för att läka volymetrisk muskelförlust, vilket uppnådde anmärkningsvärd förbättring av in situ skelettmuskelregenerering⁸.

I synnerhet kännetecknas PM av stora ytor och höga porositeter, vilket är av särskilt intresse för celladhesion och tillväxt mot minimalt invasiv cellleverans⁹. Mot bakgrund av dessa aspekter har olika biokompatibla material använts för att tillverka PMs^10,11. Dessa designbara PM som odlas tillsammans med celler erbjuder utmärkt vidhäftning, betydande mekanisk hållfasthet och mycket sammankopplade fönster, vilket kan förbättra cellproliferationen för reparation av skadade vävnader¹². I detta avseende har olika tekniker också utvecklats för att tillverka porösa sfärer^13,14. Å ena sidan producerades PM med hjälp av gasbildande medel, såsom_NH4HCO₃, som var fasthållna på grund av otillräcklig sammankoppling^15,16,17. Å andra sidan skjuvades PM direkt efter emulgering, vilket ledde till polydispers PM¹⁸. I slutändan är droppmikrofluidiktekniken baserad på emulsionsmallmetoden kanske en effektiv metod för att konstruera PM, eftersom det ofta resulterar i likformiga partiklar¹⁹. I synnerhet beror mikrosfärernas morfologiska attribut ofta på kvaliteten på de genererade emulsionsdropparna (dvs. vatten-i-olja, W/O eller olja-i-vatten, O/W), vilket kan påverka egenskaperna hos biomaterialen²⁰ avsevärt. Det är värt att notera att den fördesignade mikrofluidiska plattformen kan appliceras för att generera mikrofibrerna eller mikrosfärerna. demonstrerade produktionen av cellbelastade mikrofibrösa strukturer baserade på kapillärbaserade mikrofluidiska plattformar, som kan användas för att montera cellulära nätverk för att efterlikna naturliga vävnader²¹. tillverkade fotoniska kristallmikrokapslar genom mallreplikering av kiseldioxidkolloidala kristallpärlor genom mikrofluidikteknik, vilket kan övervinna många begränsningar av nuvarande tekniker som kräver komplex märkning och specifik apparat²².

Faktum är att motiveringen bakom användningen av denna teknik beror på olika fördelar, såsom att vara lätt i naturen, vilket inte kräver någon sofistikerad utrustning och dess bekvämlighet med att syntetisera likformiga PM för cellleverans och regenerativ medicinapplikationer. I detta sammanhang, med fördesignade komponenter av emulsionsmallning, kan PM med hög porositet och sammankoppling bekvämt erhållas från en mikrofluidisk anordning monterad av poly (vinylklorid) (PVC) rör, en glaskapillär och en nål. En W/O-emulsionsprekursor framställs genom homogenisering av en vattenlösning av gelatin och en organisk lösning av PLGA. Genom att selektivt injicera den tillämpliga delen av emulsionen i den mikrofluidiska plattformen tillverkas PM: erna med enhetliga partikelstorlekar och sammankopplade porer i hela ytan till det inre. Detta protokoll syftar till att tillverka PLGA-HOPM genom emulsion-mallning i den mikrofluidiska plattformen. Man tror att detta protokoll möjliggör reproducerbar produktion av PLGA-HOPM och kommer potentiellt att vara tillämpligt inom deras relaterade områden inom vävnadsteknik och läkemedelsscreening.

Protocol

1. Beredning av lösningar Bered PVA-stamlösningen i förväg genom att värma PVA-lösningen i ett 80 °C vattenbad och därefter placera den i kylskåpet vid 4 °C. Kyl till rumstemperatur (RT) för experimentell användning. Bered emulsionsprekursorn genom att tillsätta den vattenhaltiga gelatinlösningen (1 ml, 7,5 %, vikt/volym) till den organiska fasen av PLGA (2 ml, 2 %, w/v i diklormetan, DCM) (se materialförteckning).OBS: I allmänhet involverar mikro…

Representative Results

Baserat på tidigare arbete som optimerade huvudparametrarna1 löstes PLGA upp i det ångbara DCM-lösningsmedlet. Den primära W / O-emulsionen framställdes genom homogenisering med gelatin under ultraljudssondbehandling. Den anpassade samflödesfluidstrukturen monterades förenklat, där en spruta användes för att ständigt införa flödena. Dessutom utfördes tillräckliga sköljningsförfaranden för att eliminera PVA och gelatin i PLGA-mikrosfärer (figur 1A, kompletterande figur 1…

Discussion

I den här artikeln beskrivs en effektiv strategi för att tillverka PLGA-baserade arkitekturer, nämligen PLGA-HOPM. Det bör noteras att flera kritiska steg måste vidtas noggrant, inklusive att undvika lösningsmedelsförångning av PLGA och mild justering av ultraljudseffekten till målpositionen under beredningen av emulsionen. Dessutom kan vätskeutloppet för 20 ml sprutan justeras i viss utsträckning för att lösa fasseparationen av emulgerade prekursorer. En begränsning är dock att eftersom porogentillstånd…

Materials

Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100