Detta protokoll beskriver tillverkningen av poly(mjölksyra-co-glykolsyra)-baserade mycket öppna porösa mikrosfärer (HUMM) via den enemulsionsformuleringsbaserade facila mikrofluidiska tekniken. Dessa mikrosfärer har potentiella tillämpningar inom vävnadsteknik och läkemedelsscreening.
Jämfört med bulkställningar och direktinsprutning av celler ensam har de injicerbara modulära enheterna fått enormt intresse för att reparera felaktiga vävnader på grund av bekvämlighet i cellförpackningen, förbättrad cellretention och minimal invasivitet. Dessutom kan den porösa konformationen hos dessa mikroskalabärare förbättra medieutbytet och förbättra nivån på näringsämnen och syretillförsel. Den aktuella studien illustrerar den praktiska tillverkningen av poly(mjölksyra-co-glykolsyra)-baserade mycket öppna porösa mikrosfärer (PLGA-HOPM) genom den facila mikrofluidiska tekniken för cellleveransapplikationer. De resulterande monodisperserade PLGA-HOPM: erna hade partikelstorlekar på ~ 400 μm och öppna porer på ~ 50 μm med sammankopplade fönster. Kortfattat infördes de emulgerade oljedropparna (PLGA-lösning i diklormetan, DCM), inslagna med 7,5% (w / v) gelatinvattenfasen, i den 1% (w / v) kontinuerliga flytande poly (vinylalkohol) (PVA) vattenlösningen genom koaxialmunstycket i den anpassade mikrofluidiska installationen. Därefter utsattes mikrosfärerna för lösningsmedelsextraktion och lyofiliseringsförfaranden, vilket resulterade i produktion av HUMPM. I synnerhet spelar olika formuleringar (koncentrationer av PLGA och porogen) och bearbetningsparametrar (emulgeringskraft, nålmätare och flödeshastighet för dispergerad fas) avgörande roller i egenskaperna och egenskaperna hos de resulterande PLGA HOPM: erna. Dessutom kan dessa arkitekturer potentiellt kapsla in olika andra biokemiska ledtrådar, såsom tillväxtfaktorer, för utökad läkemedelsupptäckt och vävnadsregenereringsapplikationer.
Cellbelastade mikrosfärer erbjuder gynnsamma fördelar, såsom förbättrad cellretentionskapacitet in situ, effektiv leverans av celler och efterföljande förmåga till cellproliferation in vivo1. Hittills har många undersökningar lagts fram för att utveckla en framgångsrik byggnadsställningsstruktur för att stödja en gynnsam miljö för celler för vävnadsregenerering eller läkemedelsscreeningsapplikationer2. Hypoximiljön är dock ofta oundviklig i interiören på grund av otillräcklig tillförsel av näringsämnen / syre och ansamling av metaboliskt avfall3. För att övervinna dessa problem har mycket porösa mikrosfärer (PM) utvecklats med hjälp av olika biomaterial 4,5,6. I dynamisk kultur lider ställningarna dessutom av överdriven skjuvspänning7, och odlingsmediets instabila tillstånd kan bryta troheten hos PM. Alternativt kan poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) användas för att bearbeta PM med god mekanisk hållfasthet för dynamisk kultur1. Till exempel demonstrerade vi saminjektion av musmyoblast (C2C12) -laddad PLGA mycket öppna PM (HOPM) och humana navelvenendotelceller (HUVEC) -laddade poly (etylenglykol) ihåliga mikroroder för att läka volymetrisk muskelförlust, vilket uppnådde anmärkningsvärd förbättring av in situ skelettmuskelregenerering8.
I synnerhet kännetecknas PM av stora ytor och höga porositeter, vilket är av särskilt intresse för celladhesion och tillväxt mot minimalt invasiv cellleverans9. Mot bakgrund av dessa aspekter har olika biokompatibla material använts för att tillverka PMs10,11. Dessa designbara PM som odlas tillsammans med celler erbjuder utmärkt vidhäftning, betydande mekanisk hållfasthet och mycket sammankopplade fönster, vilket kan förbättra cellproliferationen för reparation av skadade vävnader12. I detta avseende har olika tekniker också utvecklats för att tillverka porösa sfärer13,14. Å ena sidan producerades PM med hjälp av gasbildande medel, såsomNH4HCO3, som var fasthållna på grund av otillräcklig sammankoppling15,16,17. Å andra sidan skjuvades PM direkt efter emulgering, vilket ledde till polydispers PM18. I slutändan är droppmikrofluidiktekniken baserad på emulsionsmallmetoden kanske en effektiv metod för att konstruera PM, eftersom det ofta resulterar i likformiga partiklar19. I synnerhet beror mikrosfärernas morfologiska attribut ofta på kvaliteten på de genererade emulsionsdropparna (dvs. vatten-i-olja, W/O eller olja-i-vatten, O/W), vilket kan påverka egenskaperna hos biomaterialen20 avsevärt. Det är värt att notera att den fördesignade mikrofluidiska plattformen kan appliceras för att generera mikrofibrerna eller mikrosfärerna. demonstrerade produktionen av cellbelastade mikrofibrösa strukturer baserade på kapillärbaserade mikrofluidiska plattformar, som kan användas för att montera cellulära nätverk för att efterlikna naturliga vävnader21. tillverkade fotoniska kristallmikrokapslar genom mallreplikering av kiseldioxidkolloidala kristallpärlor genom mikrofluidikteknik, vilket kan övervinna många begränsningar av nuvarande tekniker som kräver komplex märkning och specifik apparat22.
Faktum är att motiveringen bakom användningen av denna teknik beror på olika fördelar, såsom att vara lätt i naturen, vilket inte kräver någon sofistikerad utrustning och dess bekvämlighet med att syntetisera likformiga PM för cellleverans och regenerativ medicinapplikationer. I detta sammanhang, med fördesignade komponenter av emulsionsmallning, kan PM med hög porositet och sammankoppling bekvämt erhållas från en mikrofluidisk anordning monterad av poly (vinylklorid) (PVC) rör, en glaskapillär och en nål. En W/O-emulsionsprekursor framställs genom homogenisering av en vattenlösning av gelatin och en organisk lösning av PLGA. Genom att selektivt injicera den tillämpliga delen av emulsionen i den mikrofluidiska plattformen tillverkas PM: erna med enhetliga partikelstorlekar och sammankopplade porer i hela ytan till det inre. Detta protokoll syftar till att tillverka PLGA-HOPM genom emulsion-mallning i den mikrofluidiska plattformen. Man tror att detta protokoll möjliggör reproducerbar produktion av PLGA-HOPM och kommer potentiellt att vara tillämpligt inom deras relaterade områden inom vävnadsteknik och läkemedelsscreening.
I den här artikeln beskrivs en effektiv strategi för att tillverka PLGA-baserade arkitekturer, nämligen PLGA-HOPM. Det bör noteras att flera kritiska steg måste vidtas noggrant, inklusive att undvika lösningsmedelsförångning av PLGA och mild justering av ultraljudseffekten till målpositionen under beredningen av emulsionen. Dessutom kan vätskeutloppet för 20 ml sprutan justeras i viss utsträckning för att lösa fasseparationen av emulgerade prekursorer. En begränsning är dock att eftersom porogentillstånd…
The authors have nothing to disclose.
SCL, YW, RKK och AZC erkänner ekonomiskt stöd från National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 och U1605225) och Program for Innovative Research Team in Science and Technology i Fujian Province University. YSZ stöddes varken av något av dessa program eller fick betalning av något slag; I stället erkänns stöd från Brigham Research Institute.
Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |