基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

Summary

在这里，我们提出了一种基于流式细胞术的方法，用于可视化和定量单个细胞中多种衰老相关标记物。

Abstract

化疗药物可诱导癌细胞中不可修复的DNA损伤，导致细胞凋亡或过早衰老。与凋亡细胞死亡不同，衰老是抑制癌细胞繁殖的根本不同机制。几十年的科学研究揭示了衰老癌细胞在肿瘤和调节癌细胞和基质细胞的微环境中的复杂病理作用。新的证据表明，衰老是癌症治疗过程中的一个有效预后因素，因此快速准确地检测癌症样本中的衰老细胞至关重要。本文提出了一种可视化和检测癌细胞中治疗诱导的衰老（TIS）的方法。弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系用马磷酰胺（MAF）或柔红霉素（DN）处理，并检查衰老标志物，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），DNA合成标志物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）和DNA损伤标志物γ-H2AX（γH2AX）。流式细胞仪成像可以帮助在短时间内生成高分辨率的单细胞图像，以同时可视化和量化癌细胞中的三种标志物。

Introduction

多种刺激可引发细胞衰老，使细胞进入细胞周期停滞的稳定状态。这些刺激包括内在信号变化或外在应力。内在信号包括进行性端粒缩短、端粒结构改变、表观遗传修饰、蛋白稳态障碍、线粒体功能障碍和癌基因激活。外在应激包括炎症和/或组织损伤信号、辐射或化学治疗以及营养剥夺^{1，2，3，4}。在不同类型的衰老中，最常见和研究最充分的是复制性衰老、癌基因诱导的衰老 （OIS）、辐射诱导的衰老和治疗诱导的衰老 （TIS）。OIS是对异常癌基因激活产生的复制应激引起的遗传毒性损伤的急性细胞反应，并且可以在一定程度上阻止从肿瘤前病变到完全肿瘤的病理进展。当肿瘤细胞受到化疗药物或电离辐射^5，6的压力时，就会发生TIS。

衰老被认为是病理学中的双刃剑，因为它具有高度的动态性质。它最初被描述为一种有益的肿瘤抑制机制，从分裂细胞的循环池中去除受损细胞，保护器官的正常功能并抑制肿瘤生长^7，8，9。然而，新出现的证据表明衰老有黑暗的一面。衰老细胞分泌促炎细胞因子，称为衰老相关分泌表型（SASP），导致纤维化和器官功能障碍，并促进肿瘤的发生和进展¹⁰。此外，衰老的癌细胞与染色质重塑和持续DNA损伤反应（DDR）的激活同时进行表观遗传和基因表达重编程^11，12，新获得新的癌症干细胞特性³。虽然与衰老能力较弱的肿瘤相比，衰老功能的肿瘤对治疗干预的反应更好¹³，但如果衰老细胞不能被高效识别和消除，则衰老细胞的持续存在可能导致长期预后不良⁵。无论哪种方式，评估衰老的可靠方法都具有重要的临床意义，不仅对于治疗的预后，而且对于开发针对衰老细胞的新策略。

无论触发因素如何，衰老细胞都表现出一些共同的特征，包括增大、扁平、多核形态与大液泡、细胞核显著扩张、细胞核中形成富含H3K9me3的衰老相关异染色质（SAHF）、DNA损伤标记物γH2AX病灶的持续积累、活化的p53-p21^CIP1和Rb-p16^INK4a 细胞周期调节机制、稳定的 G1 细胞周期停滞、SASP 的大量诱导以及衰老相关的β半乳糖苷酶 （SA-β-gal） 活性升高¹⁴.由于没有单一标记物足以定义衰老，因此SA-β-gal活性的酶染色被认为是衰老检测的金标准，通常与H3K9me3和Ki67的免疫组化染色相结合以检测TIS¹⁵。然而，基于化学显色的SA-β-gal很难量化。在这里，我们将5-十二酰氨基荧光素-二-β-D-半乳糖基糖苷（C₁₂FDG）荧光基SA-β-gal（fSA-β-gal）检测与γH2AX和EdU掺入的DNA的免疫荧光染色相结合，使用先进的成像流式细胞仪系统鉴定C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺衰老细胞，该系统将速度，灵敏度和详细的单细胞图像与流式细胞术和显微镜无法提供的空间信息相结合。该方法可以快速生成高分辨率图像，从而允许对细胞内的荧光信号进行定位和定量，同时通过构建标准管道获得对多个样品的快速分析的许可。

Protocol

1. DLBCL细胞系与马磷酰胺或柔红霉素治疗，诱导细胞衰老 注意：该协议也适用于贴壁癌细胞。根据细胞大小，将1-2×105 个细胞放入6孔板的一个孔中，并将板在5%CO2，37°C培养箱中孵育过夜，然后在处理前。方案步骤与悬浮细胞相同，但有两个例外。首先，需要在步骤3.4之后将细胞从板上胰蛋白酶消化。其次，在胰蛋白酶消化之前无需离心即可执行洗…

Representative Results

使用图像分析软件通过加载单色控制样品的记录数据来生成补偿矩阵。如 补充图S1所示，检测到从EdU到C 12 FDG的不可忽略（系数值≥0.1）光溢出，串扰系数值为0.248，而其他通道之间的串扰不显着。用5μg/ mL MAF或20 ng / mL DN处理四种不同的DLBCL细胞系以诱导细胞衰老，并使用常规SA-β-gal染色或成像流式细胞术方法进行分析。 超过70%的KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1?…

Discussion

该方法通过明场成像和流式细胞术定量检查了化疗后四种不同DLBCL细胞系的衰老进入能力。在单细胞水平上，我们成功地在经过处理的KARPAS422和^WSU-DLCL2细胞中检测到主要的C₁₂FDG ⁺ EdU-Ki67 ⁺衰老群体，并且在较小程度上在OCI-LY1细胞中检测到，而SU-DHL6细胞系对治疗具有抗性。细胞系之间衰老进入能力的差异可以通过其独特的基因组缺陷^{来解释16，</…}

Materials

Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575