Samtidig billeddannelse og flowcytometribaseret påvisning af flere fluorescerende ældningsmarkører i terapiinducerede senescente kræftceller
Summary
Her præsenterer vi en flowcytometribaseret metode til visualisering og kvantificering af flere ældningsrelaterede markører i enkeltceller.
Abstract
Kemoterapeutiske lægemidler kan fremkalde uoprettelig DNA-skade i kræftceller, hvilket fører til apoptose eller for tidlig ældning. I modsætning til apoptotisk celledød er ældning et fundamentalt anderledes maskineri, der begrænser udbredelsen af kræftceller. Årtiers videnskabelige undersøgelser har afsløret de komplekse patologiske virkninger af senescente kræftceller i tumorer og mikromiljøer, der modulerer kræftceller og stromale celler. Nye beviser tyder på, at ældning er en potent prognostisk faktor under kræftbehandling, og derfor er hurtig og præcis påvisning af senescente celler i kræftprøver afgørende. Dette papir præsenterer en metode til at visualisere og detektere terapiinduceret ældning (TIS) i kræftceller. Diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) cellelinjer blev behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøgt for ældningsmarkøren, ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkøren 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og DNA-skademarkøren gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometerbilleddannelse kan hjælpe med at generere højopløsnings enkeltcellebilleder på kort tid for samtidig at visualisere og kvantificere de tre markører i kræftceller.
Introduction
En række stimuli kan udløse cellulær ældning, hvilket får celler til at komme ind i en tilstand af stabil cellecyklusstop. Disse stimuli omfatter iboende signalændringer eller ydre belastninger. Iboende signaler omfatter progressiv telomerforkortelse, ændringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikation, proteostaseforstyrrelser, mitokondrie dysfunktion og aktivering af onkogener. Ydre belastninger omfatter inflammatoriske og / eller vævsskadesignaler, stråling eller kemisk behandling og ernæringsmæssig deprivation 1,2,3,4. Blandt forskellige typer ældning er de mest almindeligt sete og velundersøgte replikativ ældning, onkogeninduceret ældning (OIS), strålingsinduceret ældning og terapiinduceret ældning (TIS). OIS er et akut cellulært respons på genotoksisk skade forårsaget af replikativ stress genereret af afvigende onkogen aktivering og kan til en vis grad forhindre den patologiske progression fra en præneoplastisk læsion til en fuldblæst tumor. TIS sker, når tumorceller er stresset af kemoterapeutiske lægemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Ældning betragtes som et tveægget sværd i patologi på grund af dets meget dynamiske natur. Det blev oprindeligt beskrevet som en gavnlig tumorundertrykkende mekanisme til at fjerne beskadigede celler fra den cirkulerende pool af delende celler, beskytte organernes normale funktion og hæmme tumorvækst 7,8,9. Imidlertid har nye beviser antydet en mørk side af ældning. Senescente celler udskiller proinflammatoriske cytokiner, kendt som ældningsassocieret sekretorisk fænotype (SASP), hvilket fører til fibrose og funktionsfejlsorganer og fremmer tumorinitiering og progression10. Desuden gennemgår senescente kræftceller epigenetisk og genekspressionsomprogrammering parallelt med kromatinombygning og aktivering af et vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, der for nylig har erhvervet nye kræft-stamcelleegenskaber3. Selvom ældningskompatible tumorer reagerer bedre på terapeutisk intervention sammenlignet med ældnings-uundgåelige13, kan persistensen af senescente celler føre til en dårlig langsigtet prognose, hvis de ikke effektivt identificeres og elimineres af senolytiske lægemidler5. Uanset hvad er en pålidelig metode til vurdering af ældning af betydelig klinisk interesse, ikke kun for prognosen for terapibehandling, men også for udviklingen af nye strategier rettet mod senescente celler.
Uanset forskellige udløsere udviser senescente celler nogle fælles træk, herunder forstørret, fladt, multinukleeret morfologi med store vakuoler, signifikant udvidede kerner, dannelse af H3K9me3-rig ældningsassocieret heterochromatin (SAHF) i kernen, vedvarende akkumulering af DNA-skademarkør γH2AX-foci, aktiveret p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellecyklusregulerende mekanismer, stabil G1-cellecyklusstop, massiv induktion af SASP og forhøjet ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Da ingen enkelt markør er tilstrækkelig til at definere ældning, kombineres enzymatisk farvning til SA-β-gal-aktivitet, som betragtes som guldstandarden til ældningsdetektion, normalt med immunohistokemisk farvning til H3K9me3 og Ki67 for at detektere TIS15. Imidlertid er kemisk kromogenbaseret SA-β-gal vanskelig at kvantificere. Her kombinerede vi 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) fluorescensbaseret SA-β-gal (fSA-β-gal) detektion med immunofluorescerende farvning til γH2AX og EdU-inkorporeret DNA for at identificere C12FDG + EdU-γH2AX + senescent celler ved hjælp af det avancerede billeddannelsesflowcytometersystem, som kombinerer hastighed, følsomhed og detaljerede enkeltcellebilleder med rumlig information, der ikke kan leveres af flowcytometri og mikroskopi. Denne metode muliggør hurtig generering af billeder i høj opløsning, der muliggør positionering og kvantificering af fluorescerende signaler i celler, samtidig med at den muliggør hurtig analyse af flere prøver ved at bygge standardrørledninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode undersøgte ældnings-indtastningsevnen for fire forskellige DLBCL-cellelinjer ved kemoterapibehandling med lysfeltbilleddannelse og flowcytometribaseret kvantificering. På enkeltcelleniveau påviste vi med succes større C12FDG+EdU-Ki67+ senescent populationer i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent over for behandlingen. Forskellen i ældnings-indtastningsevne blandt cellelinjer kan fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et tilskud til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
Riferimenti
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
