אנו מציגים פרוטוקול למדידת המודולי האלסטי של אזורים עשירים בקולגן בכבד רגיל וחולה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי. השימוש בו זמנית במיקרוסקופיית קיטוב מספק דיוק מרחבי גבוה ללוקליזציה של אזורים עשירים בקולגן במקטעי הכבד.
התקשות מטריקס הוכרה כאחד המניעים העיקריים להתקדמות פיברוזיס בכבד. יש לו השפעות עמוקות על היבטים שונים של התנהגות התא, כגון תפקוד התא, התמיינות ותנועתיות. עם זאת, מכיוון שתהליכים אלה אינם הומוגניים בכל האיבר, חשוב יותר ויותר להבין את השינויים בתכונות המכניות של הרקמות ברמה התאית.
כדי להיות מסוגל לעקוב אחר התקשות של אזורים עשירים בקולגן בתוך אונות הכבד, מאמר זה מציג פרוטוקול למדידת מודולי אלסטיות של רקמת הכבד בדיוק מרחבי גבוה על ידי מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM). AFM היא שיטה רגישה בעלת פוטנציאל לאפיין תכונות מכניות מקומיות, המחושבת כמודולוס של יאנג (המכונה גם אלסטי). AFM בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב יכולים לשמש לאיתור ספציפי של אזורי התפתחות פיברוזיס בהתבסס על השבירה הדו-שבירה של סיבי קולגן ברקמות. באמצעות הפרוטוקול המוצג, אפיינו את הנוקשות של אזורים עשירים בקולגן מכבדי עכברים פיברוטיים ואזורים מקבילים בכבדים של עכברי בקרה.
עלייה בולטת בנוקשות של אזורים חיוביים לקולגן נצפתה עם התפתחות פיברוזיס. הפרוטוקול המוצג מאפשר שיטה ניתנת לשחזור של מדידת AFM, בשל השימוש ברקמת כבד קבועה קלות, שניתן להשתמש בה כדי לקדם את ההבנה של שינויים יזומים של מחלות בתכונות מכניות של רקמות מקומיות והשפעתם על גורלם של תאים שכנים.
הכבד הוא איבר חיוני לשמירה על הומאוסטזיס באורגניזמים 1,2. מחלות כבד כרוניות אחראיות ל~2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולםמדי שנה 3. מקורם הנפוץ ביותר כזיהומים ויראליים, הפרעות אוטואימוניות, תסמונות מטבוליות או מחלות הקשורות לשימוש באלכוהול והם מלווים בפיברוזיס כבד מתקדם. פגיעה בכבד מעוררת תגובה דלקתית, מה שמוביל להפעלת תאים המפקידים מטריצה חוץ-תאית (ECM) בתגובה לריפוי פצעים. עם זאת, בנוכחות עלבון כרוני, עודף ECM יוצר רקמת צלקת לא פתורה בתוך הכבד, המוביל להתפתחות של פיברוזיס הכבד, שחמת הכבד, קרצינומה בכבד, ובסופו של דבר, לאי ספיקת כבד4.
פגיעה בהפטוציטים גורמת באופן מיידי לנוקשות מוגברת בכבד 5,6. זה משפיע ישירות על תפקוד הפטוציטים, מפעיל תאים סטלטים בכבד (HSCs) ופיברובלסטים פורטליים, וגורם לטרנס-דיפרנציאציה שלהם למיופיברובלסטים המכילים קולגן 7,8. התצהיר של ECM סיבי מגביר עוד יותר את נוקשות הכבד, ויוצר לולאת משוב המגבירה את עצמה של התקשות הכבד והפעלת תאים המייצרים מטריצה.
נוקשות הכבד הפכה, אם כן, לפרמטר חשוב בפרוגנוזה של מחלות כבד. את השינוי בתכונות הרקמה הביומכנית ניתן לזהות מוקדם יותר מאשר פיברוזיס ניתן לאבחן על ידי ניתוח היסטולוגי. לכן, טכניקות שונות למדידת נוקשות בכבד פותחו הן ביישומים מחקריים והן ביישומים קליניים. במסגרות קליניות, אלסטוגרפיה חולפת (TE)9,10,11,12,13 ואלסטוגרפיה של תהודה מגנטית (MRE)14,15,16,17,18 שימשו לאבחון לא פולשני של שלבים מוקדמים של נזק לכבד על ידי בדיקת נוקשות כבד גולמית 19.
ב- TE, גלי אולטרסאונד בעלי משרעת קלה ותדר נמוך (50 הרץ) מופצים דרך הכבד, ומהירותם נמדדת, המשמשת לאחר מכן לחישוב מודולוס אלסטי רקמה13. עם זאת, טכניקה זו אינה שימושית עבור חולים עם מיימת, השמנת יתר, או חללים intercostal נמוך יותר עקב שידור לא תקין של גלי אולטרסאונד דרך הרקמות המקיפות את הכבד9.
MRE מבוסס על שיטות הדמיה בתהודה מגנטית ומשתמש בגלי גזירה מכניים של 20-200 הרץ כדי לכוון לכבד. לאחר מכן נעשה שימוש ברצף הדמיה מסוים של תהודה מגנטית כדי לעקוב אחר הגלים בתוך הרקמה ולחשב את נוקשות הרקמה16. ערכי הנוקשות שדווחו בטכניקות TE ו-MRE מתואמים היטב עם מידת הפיברוזיס בכבד המתקבלת מביופסיות של דגימות כבד אנושיות המדורגות באמצעות ציוני METAVIR היסטולוגיים20 (טבלה 1). TE ו- MRE הותאמו גם למדידת נוקשות הכבד במודלים של מכרסמים למטרות מחקר21,22,23. עם זאת, מכיוון ששתי השיטות שואבות את ערכי הנוקשות מתגובת הרקמה לגלי הגזירה המתרבים, ייתכן שהערכים המתקבלים אינם משקפים את הנוקשות המכנית המוחלטת של הרקמה.
לצורך אפיון מכני ישיר של כבדי מכרסמים, פיתחו בארנס ואחרים בדיקת מודל-ג’ל-רקמה (בדיקת MGT) הכוללת הטבעה של רקמת כבד בג’ל פוליאקרילאמיד24. ג’ל זה נדחס על ידי כוח אחיד פועם שממנו ניתן לחשב את המודולוס של יאנג. בדיקת MGT מראה מתאם טוב עם בדיקת כניסה המותאמת לכבד רגיל ופיברוטי24 (טבלה 1).
טבלה 1: ערכי נוקשות הכבד ברמת התפזורת. TE ו- MRE בהשוואה למדידות מכניות ex vivo ישירות של מודולי אלסטי בכבד באמצעות הזחה ומבחני MGT עבור כבדים ממקורות שונים. היחס בין E ל-G נתון על ידי E = 2G (1 + v), כאשר v הוא היחס של פואסון למדגם; F0 עד F4 מייצגים את ניקוד הפיברוזיס במערכת הניקוד METAVIR, כאשר F0 מציין פיברוזיס נמוך או ללא כבד וכבד צ’ירוטי F4. קיצורים: TE = אלסטוגרפיה חולפת; MRE = אלסטוגרפיה של תהודה מגנטית; MGT = מודל-ג’ל-רקמה; E = מודולוס אלסטי (של יאנג); G = מודולוס גזירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
אחד החסרונות העיקריים של מדידות נוקשות כבד גנריות הוא שהן אינן מספקות רזולוציה ברמת התא של הטרוגניות הנוקשות בכבד. במהלך התקדמות הפיברוזיס, אזורים עשירים בקולגן מראים קשיחות גבוהה יותר בהשוואה לפרנכימה25,26 שמסביב. שיפוע נוקשות זה משפיע באופן מקומי על התאים התושבים וממלא תפקיד חשוב בהנעת הטרוגניות HSC27. לפיכך, שינויים בתכונות המכניות המקומיות במהלך התפתחות מחלות כבד צריכים להיות מאופיינים ברמה מיקרוסקופית כדי להבין טוב יותר את התקדמות הפיברוזיס.
AFM מאפשר למדוד את התכונות המכניות של הרקמה ברזולוציה גבוהה וברגישות כוח גבוהה. AFM משתמש בקצה של קנטילבר כדי להסיט פנימה את פני השטח של דגימה עם כוחות נמוכים כמו כמה פיקונוויטונים, מה שגורם לעיוות ברמה מיקרוסקופית או ננוסקופית בהתבסס על הגיאומטריה והגודל של הקצה שבו נעשה שימוש. תגובת הכוח של הדגימה לזן המופעל נמדדת לאחר מכן כסטייה בקנטילבר28. עקומות תזוזה בכוח נאספות מהגישה והנסיגה של הקנטילבר, אשר ניתן להתאים מודלים מתאימים של מכניקת מגע כדי להעריך את הנוקשות המקומית של הדגימה29.
בנוסף למדידת הנוקשות של אזור נתון, AFM יכול גם לספק מידע טופוגרפי על תכונות ספציפיות בדגימה, כגון המבנה של סיבי קולגן30,31,32. מחקרים רבים תיארו את היישום של AFM למדידת הנוקשות של רקמות בריאות וחולות שונות, כגון עור 32,33, ריאה 34,35, מוח36, יונק37,38,39, סחוס 40, או לב41,42,43,44 מדגימות מודל של מטופלים ועכברים. יתר על כן, AFM שימש גם במבחנה כדי לקבוע את הנוקשות של תאים ופיגומי חלבון חוץ-תאיים45,46,47.
מדידת התכונות המכניות של דגימות ביולוגיות באמצעות AFM אינה טריוויאלית בשל רכותן ושבריריותן. לפיכך, מחקרים שונים תיקנו תנאים והגדרות שונות, אשר מניבים ערכים משתנים באופן נרחב של מודולי יאנג (שנסקרו על ידי Mckee et al.48). בדומה לרקמות רכות אחרות, גם ערכי המודולוס של הכבד יאנג בדרגות שונות של פיברוזיס בכבד מראים שונות רבה (טבלה 2). ההבדלים בערכי המודולוס של יאנג נובעים מהבדלים באופן פעולת AFM, קצה קנטילבר, שיטת הכנת הדגימה, עובי הדגימה, עומק וכוחות הכניסה, סביבת רקמת הכבד במהלך המדידה ושיטת הניתוח (טבלה 2).
טבלה 2: ערכי נוקשות הכבד ברמה התאית. ערכי קשיחות הכבד המתקבלים באמצעות AFM מתארים את התכונות המכניות של הכבד ברמה התאית. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; E = מודולוס אלסטי (של יאנג); PFA = פרפורמלדהיד; PBS = מלח חצוב פוספט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידה ניתנת לשחזור של מודולי יאנג של אזורים פיברוטיים עשירים בקולגן ברקמת הכבד על ידי AFM עם לוקליזציה מדויקת המסופקת על ידי שימוש במיקרוסקופיית קיטוב. נתנו פחמן טטרה-כלוריד (CCl 4) כדי לגרום לתצהיר קולגן באופן צנטרילובולרי49 במודל עכבר, תוך חיקוי אמין של היבטים חיוניים של פיברוזיס כבד אנושי50. תמונות מיקרוסקופיות מקוטבות מאפשרות הדמיה של קולגן בכבד עקב השבירה הדו-פרצופית של סיבי הקולגן51, המאפשרת מיקום מדויק של קצה הקנטילבר מעל אזור העניין הרצוי בתוך אונת הכבד52.
הפרוטוקול המוצג מספק שיטה הניתנת לשחזור שלב אחר שלב למדידת AFM של רקמת כבד עכבר רגילה ופיברוטית. מיקרוסקופיית קיטוב מצומדת מספקת דיוק מרחבי גבוה ומאפשרת הדמיה של סיבי קולגן בשל השבירה הדו-צדדית שלהם. יתר על כן, תיאור מפורט של ניתוח עקומות הכוח המתקבל מסופק. מדידת נוקשות AFM יכולה להתבצע ברמה התאית, מה שמאפשר לעקוב אחר שינויים מקומיים בתכונות המכניות של רקמת הכבד עקב התפתחות מחלה פיברוטית. פיברוזיס בכבד אינו תהליך הומוגני המשפיע על האיבר כולו. להיפך, אזורים של ספטה פיברוטית עשירה בקולגן משולבים עם אזורים של משקעי קולגן נמוכים או ללא קולגן כלל. לפיכך, שינויים בנוקשות הם ספציפיים למיקרו-סביבה המקומית ומשפיעים רק על תאים הנמצאים במגע מקומי עם אזורים שנפגעו מפציעה. ההטרוגניות הזעירה הזו ניכרת גם בפרטים של מפות המודולוס של AFM Young, שבהן נקודות של קשיחות גבוהה גובלות באזורים של קשיחות כמעט נורמלית. השונות הזו מראה שאפילו אזור רקמת צלקת הקולגן אינו הומוגני מבחינה מכנית ודורש מדידת AFM כדי לאפיין אותה ברמה התאית (איור 4).
הפרוטוקול המוצג מאפשר מדידות של נוקשות הכבד על ידי AFM ללא תלות באוסף הכבד, שכן ניתן לאחסן את כל אונות הכבד המוטבעות ב- OCT לתקופה ממושכת ב- −80 מעלות צלזיוס. עם זאת, לאחר ניתוח הרקמה, אנו ממליצים למדוד את הדגימות תוך ~2 שבועות, שכן ראינו ריכוך הדרגתי של מקטעי רקמה המאוחסנים לפרקי זמן ארוכים יותר (איור 5).
ה-AFM המצויד במיקרוסקופיית קיטוב מאפשר איתור מדויק של אזור העניין בתוך מבנה אונות הכבד. עם זאת, יש לו גם כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת פירוש התוצאות. ערכי הנוקשות שהתקבלו כאן נמדדו בטמפרטורת החדר. אנו מניחים כי ההשפעות של הטמפרטורה על התכונות המכניות של רקמות רכות יהיה קטן; עם זאת, זו עשויה להיות אחת הסיבות להבדלים בין ערכי in vivo המדווחים של תכונות מכניות של רקמות כבד לבין הערכים במחקר זה.
יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח AFM של רקמת הכבד עד 3 שעות, אשר דורש קיבוע קל של הרקמה. הקיבוע המתון של מקטעי הרקמות, כמו גם מחזור ההפשרה, ישפיעו ככל הנראה על הערכים המוחלטים של המודולוס של יאנג. לפיכך, הערכים המדווחים של המודולי של יאנג עשויים להיות שונים מערכי in vivo . מחקרים נוספים נדרשים כדי לייעל את הפרוטוקול למדידת ערכים מוחלטים של מודולוס יאנג מקטעי כבד, אשר עשוי להיות מושגת על ידי שיטה אחרת לקיבוע של רקמת הכבד64.
עם זאת, ראינו נוקשות גוברת של אזורים עשירים בקולגן בכבדים של עכברים שטופלו ב-CCl4 במשך 3 שבועות, בהשוואה ל-6 שבועות. שינויים כאלה תואמים את התקדמות הפיברוזיס במהלך פציעה ממושכת (איור 4) ומראים שניתן לחקור הבדלים יחסיים בין טיפולים שונים באמצעות הפרוטוקול המוצג. זה עולה בקנה אחד עם התצפיות של Calò et al., שהראו כי מקטעי כבד קבועים קלות מראים הבדלים דומים בערכי הנוקשות בין אזורים עשירים בקולגן וחסרי קולגן כמו ברקמה טרייה25.
השתמשנו ב-SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (קבוע קפיץ תיאורטי ~0.09 N/m) ששונה עם קצה כדורי בקוטר 5.7 מיקרומטר כדי למזער את ההפרעה המכנית של רקמת הכבד במהלך המדידות. חרוז של 5.7 מיקרומטר איפשר כניסה מספקת של הדגימה כדי לבדוק את קשיחותה תוך שמירה על שלמותה. חרוז בקוטר קטן יותר יכול לשמש, לאחר מספר אופטימיזציות, לקבלת רזולוציה גבוהה יותר במפות הנוקשות, אך עלול להוביל להערכת יתר נוספת של ערכי המודולוס של יאנג (לפרטים נוספים, ראו Crichton et al.65). באמצעות אנסמבל החרוזים שצוין, הצלחנו לאפיין את קשיחות הדגימה בטווח רחב, מעשרות יחידות של Pa ועד ~ 100 kPa.
המודל של סנדון שימש לגזירת המודולוס של יאנג מעקומות כוח, שכן הוא מאפשר ניתוח של כניסות עמוקות עם גשושיות קולואידיות62. המודל של סנדון, בניגוד למודל של הרץ, אינו סובל מהאילוץ שרדיוס המגע חייב להיות קטן בהרבה מרדיוס הכדור. עוד הוא מניח כי עובי הדגימה גדול פי כמה מעומק הכניסה30,66. במחקר הנוכחי, הכניסה הייתה ~2 מיקרומטר עם גודל חרוז של 5.7 מיקרומטר ועובי דגימה של 30 מיקרומטר באזורים עשירים בקולגן; לפיכך, המודל של סנדון היה מתאים. מודלים אחרים63 בהתחשב בכוח ההידבקות בין קצה למצע יכולים לשמש לסוגים שונים של רקמות.
אנליזה ב-AtomicJ מיישמת תיקונים לעובי הסופי של הדגימות כדי למזער את תרומתו של מצע תוך הפקת מודולוס62,67 של יאנג. בניתוח עקומות הכוח המתקבלות, השתמשנו ביחס פואסון יחיד של 0.45, אשר הומלץ בעבר לאיברי רקמות רכות24. לקירוב זה אין השפעה משמעותית על הערכים המחושבים של המודולוס של יאנג, שכן השינוי בערך היחס של פואסון מ-0.4 ל-0.5 גורם רק לירידה של פי 0.893 בערכי המודולוס של יאנג המחושבים על פי משוואת סנדון. בהתחשב בהבדלים הרבים במודולוס של יאנג בין משכי הזמן השונים של טיפולי CCl4, השגיאות הנוצרות על ידי קירוב היחס של פואסון הן שוליות בלבד.
השתמשנו בעקומות משיכה כדי לחשב ערכי קשיחות, מכיוון שהתעניינו בתגובה האלסטית של הרקמה לעומס שמספק הקנטילבר ולא בתגובה הפלסטית לכניסה68. בשל התגובה הוויסקואלסטית של הרקמה הרכה, עקומות נסיגה מתאימות עשויות להעריך יתר על המידה את המודולוס של יאנג, שיש לזכור זאת. יתר על כן, ראינו שניתוח נתונים עם עקומי גישה מניב מגמות דומות בערכי הנוקשות בין אזורים פיברוטיים לאזורי בקרה, אם כי הערכים האבסולוטיים נמוכים יותר בהתאמה (הנתונים לא מוצגים).
תוך כדי אופטימיזציה של הפרוטוקול, זיהינו מספר שלבים קריטיים לשחזור המדידות. ראשית, חשוב לוודא שהחרוז נמצא בערך במרכז הקצה השקוף בזמן ההצמדה לקנטילבר. זה מונע חוסר איזון מכני אפשרי במהלך הכניסה. שנית, במהלך קיבוע הכבד עם PFA, יש צורך להקפיד על מגבלות הזמן להפשרה וקיבוע. שינוי התזמון של שלב זה עלול להשפיע קשות על התכונות המכניות של מקטעי רקמות. שלישית, יש לכייל את הקנטיליבר שוב ושוב עם ניטור רציף וקלט של ערכי טמפרטורה בו-זמניים כדי למנוע ממצאים המתרחשים בערכי קשיחות עקב תנודות טמפרטורה. לבסוף, אין למדוד חתך כבד יחיד במשך יותר מ-3 שעות מההכנה, שכן PBS שכבת-על עלולה להתאדות על פני תקופות ארוכות יותר. הקוראים יכולים לעיין בטבלת פתרון הבעיות (טבלה 3) לפתרון בעיות שנתקלו בהן במהלך מדידת AFM, שגם היא נדונה בהרחבה ב- Norman et al.46.
טבלה 3: מדריך לפתרון בעיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
הפרוטוקול המוצג מאפשר בדיקת AFM ניתנת לשחזור של רקמת הכבד. יש לו פוטנציאל לחשוף מידע על התפתחות ורגרסיה בסופו של דבר של מחלת כבד פיברוטית ברמה מיקרוסקופית והוא יכול לתרום לפיתוח טיפולים המכוונים לאזורי צלקת פיברוטיים שנוצרו במהלך התקדמות מחלת כבד כרונית.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות המענקים של הרפובליקה הצ’כית (18-02699S), פרויקט המחקר המוסדי של האקדמיה הצ’כית למדעים (RVO 68378050), ופרויקט MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, מרכז הדרכה-CZ של קונסורציום הוראה-ERIC האיחוד האירופי, במימון פרויקט התשתית MEYS CR LM2018127 והקרן האירופית לפיתוח אזורי-פרויקט “UP CIISB” (לא. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) תמך כספית במדידות בננו-ביוטכנולוגיה של CF, CEITEC MU. אנו מכירים גם במתקן הליבה של מיקרוסקופיית אור, IMG CAS, פראג, צ’כיה, הנתמך על ידי MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) ו- RVO: 68378050-KAV-NPUI, על תמיכתם בהדמיית המיקרוסקופיה המוצגת כאן.
AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
Cryotome | Leica | CM1950 | |
Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
AtomicJ v2.3.1 | |||
Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |