Vi presenterer en protokoll for å måle elastisk moduli av kollagenrike områder i normal og syk lever ved hjelp av atomkraftmikroskopi. Samtidig bruk av polarisasjonsmikroskopi gir høy romlig presisjon for lokalisering av kollagenrike områder i leverseksjonene.
Matrix stivning har blitt anerkjent som en av de viktigste driverne for progresjon av leverfibrose. Det har dype effekter på ulike aspekter av celleadferd som cellefunksjon, differensiering og motilitet. Men da disse prosessene ikke er homogene gjennom hele orgelet, har det blitt stadig viktigere å forstå endringer i de mekaniske egenskapene til vev på mobilnivå.
For å kunne overvåke avstivningen av kollagenrike områder i leverlappene, presenterer dette papiret en protokoll for måling av levervevselastisk moduli med høy romlig presisjon ved atomkraftmikroskopi (AFM). AFM er en sensitiv metode med potensial til å karakterisere lokale mekaniske egenskaper, beregnet som Youngs (også referert til som elastisk) modul. AFM kombinert med polarisasjonsmikroskopi kan brukes til å spesifikt lokalisere områdene av fibroseutvikling basert på birefringence av kollagenfibre i vev. Ved hjelp av den presenterte protokollen karakteriserte vi stivheten i kollagenrike områder fra fibrotiske muselever og tilsvarende områder i leveren til kontrollmus.
En fremtredende økning i stivheten i kollagenpositive områder ble observert med fibroseutvikling. Den presenterte protokollen tillater en svært reproduserbar metode for AFM-måling, på grunn av bruk av mildt fast levervev, som kan brukes til å fremme forståelsen av sykdomsinitierte endringer i lokale vevsmekaniske egenskaper og deres effekt på skjebnen til naboceller.
Leveren er et viktig organ for å opprettholde homeostase i organismer 1,2. Kroniske leversykdommer står for ~ 2 millioner dødsfall over hele verden årlig3. De stammer oftest som virusinfeksjoner, autoimmune sykdommer, metabolske syndromer eller alkoholmisbruksrelaterte sykdommer og ledsages av progressiv leverfibrose. Leverskade fremkaller en inflammatorisk respons, noe som fører til aktivering av celler som deponerer ekstracellulær matriks (ECM) i en sårhelingsrespons. Imidlertid, i nærvær av en kronisk fornærmelse, danner overskytende ECM uløst arrvev i leveren, noe som fører til utvikling av leverfibrose, skrumplever, leverkarsinom og til slutt til leversvikt4.
Hepatocyttskade resulterer umiddelbart i økt leverstivhet 5,6. Dette påvirker direkte hepatocyttfunksjonen, aktiverer hepatiske stellatceller (HSC) og portalfibroblaster, og resulterer i transdifferensiering til kollagenavsettende myofibroblaster 7,8. Avsetningen av fibrøs ECM øker ytterligere leverstivheten, og skaper en selvforsterkende tilbakemeldingssløyfe av leverstivning og matriksproduserende celleaktivering.
Leverstivhet har dermed blitt en viktig parameter i leversykdomsprognosen. Endringen i biomekaniske vevsegenskaper kan oppdages tidligere enn fibrose kan diagnostiseres ved histologisk analyse. Derfor har ulike teknikker for måling av leverstivhet blitt utviklet i både forskning og kliniske applikasjoner. I kliniske omgivelser har forbigående elastografi (TE) 9,10,11,12,13 og magnetisk resonanselastografi (MRE)14,15,16,17,18 blitt ansatt for å ikke-invasivt diagnostisere tidlige stadier av leverskade ved å undersøke brutto leverstivhet 19.
I TE forplantes ultralydbølger med mild amplitude og lav frekvens (50 Hz) gjennom leveren, og deres hastighet måles, som deretter brukes til å beregne vevselastisk modul13. Imidlertid er denne teknikken ikke nyttig for pasienter med ascites, fedme eller lavere interkostale rom på grunn av feil overføring av ultralydbølgene gjennom vevet rundt leveren9.
MRE er basert på magnetisk resonans imaging modalitet og bruker 20-200 Hz mekaniske skjærbølger for å målrette leveren. En spesifikk magnetisk resonansavbildningssekvens brukes deretter til å spore bølgene inne i vevet og for å beregne vevsstivheten16. Stivhetsverdier rapportert med både TE- og MRE-teknikker korrelerer godt med graden av leverfibrose fra biopsier av humane leverprøver rangert ved histologisk METAVIR-skår20 (tab 1). TE og MRE er også tilpasset for måling av leverstivhet i gnagermodeller for forskningsformål21,22,23. Men da begge metodene avleder stivhetsverdiene fra vevets respons på de forplantende skjærbølgene, kan de oppnådde verdiene ikke gjenspeile vevets absolutte mekaniske stivhet.
For en direkte mekanisk karakterisering av gnagerlever utviklet Barnes og medarbeidere en modell-gel-vevsanalyse (MGT-analyse) som involverte innebygging av levervev i polyakrylamidgel24. Denne gelen komprimeres av en pulserende jevn kraft som Youngs modul kan beregnes fra. MGT-analysen viser god korrelasjon med en innrykksanalyse tilpasset både normal og fibrotisk lever24 (tab 1).
Tabell 1: Leverstivhetsverdier ved bulknivå. TE og MRE sammenlignet med direkte ex vivo mekaniske målinger av leverelastisk moduli ved bruk av innrykk og MGT-analyser for lever fra forskjellige kilder. Forholdet mellom E og G er gitt ved E = 2G (1 + v), hvor v er Poissons forhold til prøven; F0 til F4 representerer fibroseskår i METAVIR scoring system, med F0 som angir lav eller ingen fibrose og F4 cirrhotisk lever. Forkortelser: TE = forbigående elastografi; MRE = magnetisk resonans elastografi; MGT = modell-gel-vev; E = elastisk (Youngs) modul; G = skjærmodul. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
En av de største ulempene med generiske leverstivhetsmålinger er at de ikke gir cellenivåoppløsning av stivhet heterogenitet i leveren. Under utviklingen av fibrose viser kollagenrike områder høyere stivhet sammenlignet med den omkringliggende parenchymen25,26. Denne stivhetsgradienten påvirker lokalt de bosatte cellene og spiller en viktig rolle i å drive HSC-heterogenitet27. Dermed må endringer i lokale mekaniske egenskaper under utvikling av leversykdom karakteriseres på mikroskopisk nivå for bedre å forstå fibroseprogresjon.
AFM gjør at de mekaniske egenskapene til vev kan måles med høy oppløsning og høy kraftfølsomhet. AFM bruker spissen av en utkrager for å rykke inn overflaten av en prøve med krefter så lave som flere piconewtons, og induserer en deformasjon på et mikroskopisk eller nanoskopisk nivå basert på geometrien og størrelsen på spissen som brukes. Kraftresponsen til prøven til den påførte belastningen måles deretter som avbøyningen i utkrageren28. Kraftforskyvningskurver hentes fra tilnærming og tilbaketrekning av utkrageren, som kan utstyres med passende kontaktmekaniske modeller for å evaluere den lokale stivheten til prøven29.
I tillegg til å måle stivheten til et gitt område, kan AFM også gi topografisk informasjon om spesifikke egenskaper i prøven, for eksempel strukturen av kollagenfibre30,31,32. Flere studier har beskrevet anvendelsen av AFM for å måle stivheten til forskjellige sunne og syke vev, for eksempel hud 32,33, lunge 34,35, hjerne36, bryst37,38,39, brusk 40 eller hjerte41,42,43,44 fra både pasient- og musemodellprøver. Videre har AFM også blitt brukt in vitro for å bestemme stivheten til celler og ekstracellulære proteinstillaser45,46,47.
Måling av de mekaniske egenskapene til biologiske prøver ved bruk av AFM er ikke-triviell på grunn av deres mykhet og skjøthet. Dermed har ulike studier standardisert forskjellige forhold og innstillinger, noe som gir mye svingende verdier av Youngs moduli (gjennomgått av Mckee et al.48). I likhet med annet bløtvev viser også leveren Youngs modulverdier ved ulike grader av leverfibrose stor variasjon (tab 2). Forskjellene i Youngs modulverdier stammer fra forskjeller i modus for AFM-drift, utkragetips, prøveprepareringsmetode, prøvetykkelse, innrykksdybde og krefter, levervevsmiljø under måling og analysemetode (tabell 2).
Tabell 2: Leverstivhetsverdier på cellenivå. Leverstivhetsverdier oppnådd ved bruk av AFM beskriver leverens mekaniske egenskaper på mobilnivå. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Dette papiret beskriver en protokoll for reproduserbar måling av Youngs moduli av kollagenrike fibrotiske områder i levervev ved AFM med en presis lokalisering gitt ved bruk av polarisasjonsmikroskopi. Vi administrerte karbontetraklorid (CCl4) for å indusere kollagenavsetning på en sentrilobulær måte49 i en musemodell, som pålitelig etterligner viktige aspekter ved human leverfibrose50. Polariserte mikroskopiske bilder muliggjør visualisering av kollagen i leveren på grunn av birefringence av kollagenfibre51, noe som muliggjør nøyaktig posisjonering av utkragespissen over ønsket interesseområde i hepatisk lobule52.
Den presenterte protokollen gir en trinnvis reproduserbar metode for AFM-måling av normalt og fibrotisk muselevervev. Koblet polarisasjonsmikroskopi gir høy romlig presisjon og muliggjør visualisering av kollagenfibre på grunn av deres birefringence. Videre er det gitt en detaljert beskrivelse av analysen av de oppnådde kraftkurvene. AFM-stivhetsmåling kan utføres på mobilnivå, noe som gjør at lokale endringer i levervevets mekaniske egenskaper på grunn av utvikling av fibrotisk sykdom kan overvåkes. Leverfibrose er ikke en homogen prosess som påvirker hele organet. Tvert imot er områder med kollagenrik fibrotisk septa ispedd områder med lave eller ingen kollagenavsetninger. Dermed er stivhetsendringer spesifikke for det lokale mikromiljøet og påvirker bare celler lokalt i kontakt med områder som er skadet av skade. Denne mikroskalaen av stivhet heterogenitet er også tydelig i detaljene i AFM Youngs modulkart, hvor punkter med høy stivhet grenser til områdene med nesten normal stivhet. Denne variasjonen viser at selv kollagen arrvevsområde ikke er mekanisk homogent og krever AFM-måling for å kunne karakteriseres på cellenivå (figur 4).
Den presenterte protokollen tillater målinger av leverstivhet ved AFM uavhengig av leversamlingen, da hele leverlappene innebygd i OCT kan lagres i en lengre periode ved -80 ° C. Når vevet er seksjonert, anbefaler vi imidlertid å måle prøvene innen ~ 2 uker, da vi har observert en gradvis mykning av vevsseksjoner lagret i lengre perioder (figur 5).
AFM utstyrt med polarisasjonsmikroskopi gjør det mulig å nøyaktig lokalisere interesseområdet i leveren lobule struktur. Det har imidlertid også noen begrensninger som må vurderes når man tolker resultatene. Stivhetsverdiene oppnådd her ble målt ved romtemperatur. Vi antar at effekten av temperatur på de mekaniske egenskapene til bløtvev vil være liten; Dette kan imidlertid være en av årsakene til forskjeller mellom de rapporterte in vivo-verdiene av mekaniske egenskaper til levervev og verdiene i denne studien.
Videre tillater denne protokollen AFM-analyse av levervev i opptil 3 timer, noe som krever mild fiksering av vevet. Den milde fiksering av vevsseksjoner, samt fryse-tine-syklusen, vil mest sannsynlig påvirke de absolutte verdiene til Youngs modul. Dermed kan de rapporterte verdiene til Youngs moduli avvike fra in vivo-verdier . Ytterligere studier er nødvendig for å optimalisere protokollen for måling av absolutte verdier av Youngs modul fra leverseksjoner, som kan oppnås ved en annen metode for fiksering av levervev64.
Likevel observerte vi økende stivhet av kollagenrike områder i leveren til mus behandlet med CCl4 i 3 uker sammenlignet med 6 uker. Slike forandringer samsvarer med fibroseprogresjon ved langvarig skade (figur 4) og viser at relative forskjeller kan undersøkes mellom ulike behandlinger med presentert protokoll. Dette er i samsvar med observasjonene til Calò og medarbeidere, som viste at mildt fikserte leverseksjoner viser lignende forskjeller i stivhetsverdier mellom kollagenrike og kollagenfattige områder som i ferskt vev25.
Vi brukte SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjærkonstant ~ 0,09 N / m) modifisert med en 5,7 μm diameter sfærisk spiss for å minimere mekanisk forstyrrelse av levervevet under målinger. En 5,7 μm perle muliggjorde tilstrekkelig innrykk av prøven for å undersøke stivheten samtidig som den bevarte integriteten. En perle med mindre diameter kan brukes, etter flere optimaliseringer, for å få høyere oppløsning i stivhetskartene, men kan føre til ytterligere overestimering av Youngs modulverdier (for flere detaljer, se Crichton et al.65). Ved hjelp av det spesifiserte cantilever-perleensemblet var vi i stand til å karakterisere prøvestivhet i et bredt spekter, fra titalls enheter av Pa til ~ 100 kPa.
Sneddons modell ble brukt til å utlede Youngs modul fra kraftkurver, da den tillater analyse av dype innrykk med kolloidale sonder62. Sneddons modell, i motsetning til Hertz modell, lider ikke av begrensningen at kontaktradiusen må være mye mindre enn kuleradiusen. Det antas videre at prøvetykkelsen er flere ganger større enn innrykksdybden30,66. I denne studien var innrykket ~2 μm med en dråpestørrelse på 5,7 μm og en prøvetykkelse på 30 μm i kollagenrike områder; dermed var Sneddons modell passende. Andre modeller63 med tanke på adhesjonskraften mellom spiss og substrat kan brukes til forskjellige typer vev.
Analyse i AtomicJ implementerer korreksjoner for den endelige tykkelsen på prøvene for å minimere bidraget fra et substrat mens Youngs modul62,67 utledes. I analysen av de oppnådde kraftkurvene brukte vi et enkelt Poissons forhold på 0,45, som tidligere er anbefalt for bløtvevsorganer24. Denne tilnærmingen har ingen signifikant effekt på beregnede verdier av Youngs modul, da endringen i verdien av Poissons forhold fra 0,4 til 0,5 bare resulterer i en 0,893x reduksjon i Youngs modulverdier beregnet i henhold til Sneddons ligning. Gitt de mange forskjellene i Youngs modul mellom de forskjellige varighetene av CCl 4-behandlinger, er feilene som produseres ved å tilnærme Poissons forhold bare marginale.
Vi brukte tilbaketrekningskurver for å beregne stivhetsverdier, da vi var interessert i vevets elastiske respons på belastningen fra utkrageren i stedet for i plastresponsen på innrykk68. På grunn av den viskoelastiske responsen til bløtvevet, kan passende tilbaketrekningskurver overvurdere Youngs modul, noe som bør huskes. Videre har vi observert at dataanalyse med tilnærmingskurver gir tilsvarende trender i stivhetsverdier mellom fibrotiske områder og kontrollområder, selv om absoluttverdiene er tilsvarende lavere (data ikke vist).
Mens vi optimaliserte protokollen, identifiserte vi flere trinn som er kritiske for reproduserbarheten av målingene. For det første er det viktig å sikre at perlen er omtrent i midten av den gjennomsiktige spissen mens den festes til utkrageren. Dette forhindrer mulig mekanisk ubalanse under innrykk. For det andre, under leverfiksering med PFA, er det nødvendig å følge tidsgrensene for tining og fiksering strengt. Endring av tidspunktet for dette trinnet kan ha alvorlig innvirkning på de mekaniske egenskapene til vevsseksjoner. For det tredje må utkragingen kalibreres gjentatte ganger med kontinuerlig overvåking og inntasting av samtidige temperaturverdier for å unngå artefakter som oppstår i stivhetsverdier på grunn av temperatursvingninger. Sist, en enkelt leverseksjon bør ikke måles i mer enn 3 timer fra forberedelse, da overlaid PBS kan fordampe over lengre perioder. Leserne kan se feilsøkingstabellen (tabell 3) for å løse problemer som oppstod under AFM-målingen, også diskutert i lengde i Norman et al.46.
Tabell 3: Feilsøkingsveiledning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Den presenterte protokollen tillater reproduserbar AFM-sondering av levervev. Det har potensial til å avsløre informasjon om utvikling og eventuell regresjon av fibrotisk leversykdom på mikroskopisk nivå og kan bidra til utvikling av terapier rettet mot fibrotiske arrregioner dannet under utviklingen av kronisk leversykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grant Agency of the Czech Republic (18-02699S), Institutional Research Project of the Czech Academy of Sciences (RVO 68378050) og MEYS CR-prosjektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU-konsortium, finansiert av MEYS CR infrastrukturprosjekt LM2018127 og European Regional Development Fund-Project “UP CIISB” (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) støttet målingene ved CF Nanobiotechnology, CEITEC MU, økonomisk. Vi anerkjenner også kjernefasiliteten for lysmikroskopi, IMG CAS, Praha, Tsjekkia, støttet av MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) og RVO: 68378050-KAV-NPUI, for deres støtte med mikroskopiavbildningen som presenteres her.
AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
Cryotome | Leica | CM1950 | |
Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
AtomicJ v2.3.1 | |||
Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |