Vi presenterar ett protokoll för att mäta den elastiska modulen i kollagenrika områden i normal och sjuk lever med hjälp av atomkraftsmikroskopi. Samtidig användning av polarisationsmikroskopi ger hög rumslig precision för lokalisering av kollagenrika områden i leversektionerna.
Matrisförstyvning har erkänts som en av de viktigaste drivkrafterna för utvecklingen av leverfibros. Det har djupgående effekter på olika aspekter av cellbeteende såsom cellfunktion, differentiering och rörlighet. Men eftersom dessa processer inte är homogena i hela organet har det blivit allt viktigare att förstå förändringar i vävnadernas mekaniska egenskaper på cellulär nivå.
För att kunna övervaka förstyvningen av kollagenrika områden i leverloberna presenterar detta papper ett protokoll för mätning av levervävnadselastiska moduler med hög rumslig precision med atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM är en känslig metod med potential att karakterisera lokala mekaniska egenskaper, beräknad som Youngs (även kallad elastisk) modul. AFM i kombination med polarisationsmikroskopi kan användas för att specifikt lokalisera områdena för fibrosutveckling baserat på birefringens av kollagenfibrer i vävnader. Med hjälp av det presenterade protokollet karakteriserade vi styvheten hos kollagenrika områden från fibrotiska muslever och motsvarande områden i levern hos kontrollmöss.
En framträdande ökning av styvheten hos kollagenpositiva områden observerades med fibrosutveckling. Det presenterade protokollet möjliggör en mycket reproducerbar metod för AFM-mätning, på grund av användningen av milt fixerad levervävnad, som kan användas för att främja förståelsen av sjukdomsinitierade förändringar i lokala vävnadsmekaniska egenskaper och deras effekt på ödet för angränsande celler.
Levern är ett viktigt organ för att upprätthålla homeostas i organismer 1,2. Kroniska leversjukdomar står för ~ 2 miljoner dödsfall världen över årligen3. De har oftast sitt ursprung som virusinfektioner, autoimmuna störningar, metaboliska syndrom eller alkoholmissbruksrelaterade sjukdomar och åtföljs av progressiv leverfibros. Leverskada framkallar ett inflammatoriskt svar, vilket leder till aktivering av celler som deponerar extracellulär matris (ECM) i ett sårläkningssvar. Men i närvaro av en kronisk förolämpning bildar överskott av ECM olöst ärrvävnad i levern, vilket leder till utveckling av leverfibros, cirros, leverkarcinom och i slutändan till leversvikt4.
Hepatocytskada resulterar omedelbart i ökad leverstyvhet 5,6. Detta påverkar direkt hepatocytfunktionen, aktiverar leverstellatceller (HSC) och portalfibroblaster och resulterar i deras transdifferentiering till kollagendeponerande myofibroblaster 7,8. Avsättningen av fibrös ECM ökar ytterligare leverstyvheten, vilket skapar en självförstärkande återkopplingsslinga av leverförstyvning och matrisproducerande cellaktivering.
Leverstelhet har därmed blivit en viktig parameter i leversjukdomsprognosen. Förändringen i biomekaniska vävnadsegenskaper kan detekteras tidigare än fibros kan diagnostiseras genom histologisk analys. Därför har olika tekniker för mätning av leverstelhet utvecklats inom både forskning och kliniska tillämpningar. I kliniska miljöer har övergående elastografi (TE)9,10,11,12,13 och magnetisk resonanselastografi (MRE)14,15,16,17,18 använts för att icke-invasivt diagnostisera tidiga stadier av leverskador genom att undersöka grov leverstelhet 19.
I TE sprids ultraljudsvågor med mild amplitud och låg frekvens (50 Hz) genom levern och deras hastighet mäts, som sedan används för att beräkna vävnadselasticmodul13. Denna teknik är emellertid inte användbar för patienter med ascites, fetma eller lägre interkostala utrymmen på grund av felaktig överföring av ultraljudsvågorna genom vävnaderna som omger levern9.
MRE är baserad på magnetisk resonansavbildningsmodalitet och använder 20-200 Hz mekaniska skjuvvågor för att rikta in sig på levern. En specifik magnetisk resonansavbildningssekvens används sedan för att spåra vågorna inuti vävnaden och för att beräkna vävnadsstyvheten16. Styvhetsvärden som rapporterats med både TE- och MRE-tekniker korrelerar väl med graden av leverfibros erhållen från biopsier av humana leverprover rankade med hjälp av histologiska METAVIR-poäng20 (tabell 1). TE och MRE har också anpassats för mätning av leverstelhet i gnagarmodeller för forskningsändamål21,22,23. Men eftersom båda metoderna härleder styvhetsvärdena från vävnadens svar på de förökande skjuvvågorna, kanske de erhållna värdena inte återspeglar vävnadens absoluta mekaniska styvhet.
utvecklade en modell-gel-vävnadsanalys (MGT-analys) som involverade inbäddning av levervävnad i levervävnad i polyakrylamidgel24. Denna gel komprimeras av en pulserad likformig kraft från vilken Youngs modul kan beräknas. MGT-analysen visar en god korrelation med en indragningsanalys anpassad för både normala och fibrotiska lever24 (tabell 1).
Tabell 1: Leverstyvhetsvärden på bulknivå. TE och MRE jämfört med direkta ex vivo mekaniska mätningar av leverelastic moduli med hjälp av indragning och MGT-analyser för lever från olika källor. Förhållandet mellan E och G ges av E = 2G (1 + v), där v är Poissons förhållande mellan provet; F0 till F4 representerar fibrospoängen i METAVIR-poängsystemet, med F0 som betecknar låg eller ingen fibros och F4-cirrotiska lever. Förkortningar: TE = övergående elastografi; MRE = magnetisk resonans elastografi; MGT = modell-gel-vävnad; E = elastisk (Youngs) modul; G = skjuvmodul. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
En av de största nackdelarna med generiska leverstyvhetsmätningar är att de inte ger cellulär upplösning av styvhet heterogenitet i levern. Under utvecklingen av fibros visar kollagenrika områden högre styvhet jämfört med det omgivande parenkymet25,26. Denna styvhetsgradient påverkar lokalt de bosatta cellerna och spelar en viktig roll för att driva HSC-heterogenitet27. Således måste förändringar i lokala mekaniska egenskaper under leversjukdomsutveckling karakteriseras på mikroskopisk nivå för att bättre förstå fibrosprogression.
AFM gör att vävnadens mekaniska egenskaper kan mätas med hög upplösning och hög kraftkänslighet. AFM använder spetsen på en cantilever för att dra in ytan på ett prov med krafter så låga som flera piconewtons, vilket inducerar en deformation på mikroskopisk eller nanoskopisk nivå baserat på geometrin och storleken på den använda spetsen. Provets kraftrespons på den applicerade töjningen mäts sedan som avböjningen i utskjutande28. Kraftförskjutningskurvor samlas in från inflygningen och indragningen av cantileveren, som kan utrustas med lämpliga kontaktmekanikmodeller för att utvärdera provets lokala styvhet29.
Förutom att mäta styvheten i ett visst område kan AFM också ge topografisk information om specifika egenskaper i provet, såsom strukturen hos kollagenfibrer30,31,32. Flera studier har beskrivit tillämpningen av AFM för att mäta styvheten hos olika friska och sjuka vävnader, såsom hud 32,33, lunga 34,35, hjärna36, bröst37,38,39, brosk 40 eller hjärta41,42,43,44 från både patient- och musmodellprover. Dessutom har AFM också använts in vitro för att bestämma styvheten hos celler och extracellulära proteinställningar45,46,47.
Mätningen av de mekaniska egenskaperna hos biologiska prover med AFM är nontrivial på grund av deras mjukhet och bräcklighet. Således har olika studier standardiserat olika förhållanden och inställningar, vilket ger mycket fluktuerande värden på Youngs moduli (granskad av Mckee et al.48). I likhet med andra mjuka vävnader visar lever Youngs modulvärden vid olika grader av leverfibros också omfattande variation (tabell 2). Skillnaderna i Youngs modulvärden härrör från skillnader i läget för AFM-drift, utskjutande spets, provberedningsmetod, provtjocklek, indragningsdjup och krafter, levervävnadsmiljö under mätning och analysmetod (tabell 2).
Tabell 2: Leverstyvhetsvärden på cellnivå. Leverstyvhetsvärden erhållna med AFM beskriver leverns mekaniska egenskaper på cellnivå. Förkortningar: AFM = atomkraftsmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Detta dokument beskriver ett protokoll för reproducerbar mätning av Youngs moduli av kollagenrika fibrotiska områden i levervävnad av AFM med en exakt lokalisering som tillhandahålls genom användning av polarisationsmikroskopi. Vi administrerade koltetraklorid (CCl4) för att inducera kollagenavsättning på ett centrilobulärt sätt49 i en musmodell, vilket på ett tillförlitligt sätt efterliknade viktiga aspekter av mänsklig leverfibros50. Polariserade mikroskopiska bilder möjliggör visualisering av kollagen i levern på grund av birefringens av kollagenfibrer51, vilket möjliggör exakt positionering av cantileverspetsen över det önskade intresseområdet inom leverlobule52.
Det presenterade protokollet tillhandahåller en steg-för-steg reproducerbar metod för AFM-mätning av normal och fibrotisk muslevervävnad. Kopplad polarisationsmikroskopi ger hög rumslig precision och möjliggör visualisering av kollagenfibrer på grund av deras birefringence. Vidare tillhandahålls en detaljerad beskrivning av analysen av de erhållna kraftkurvorna. AFM-styvhetsmätning kan utföras på cellnivå, vilket gör det möjligt att övervaka lokala förändringar i levervävnadens mekaniska egenskaper på grund av att utveckla fibrotisk sjukdom. Leverfibros är inte en homogen process som påverkar hela organet. Tvärtom varvas områden med kollagenrika fibrotiska septa med områden med låga eller inga kollagenavlagringar. Således är styvhetsförändringar specifika för den lokala mikromiljön och påverkar endast celler lokalt i kontakt med områden som skadats av skada. Denna mikroskala av styvhetsheterogenitet framgår också av detaljerna i AFM Youngs modulkartor, där punkter med hög styvhet gränsar till områdena med nästan normal styvhet. Denna variation visar att även kollagenärrvävnadsområdet inte är mekaniskt homogent och kräver att AFM-mätning karakteriseras på cellnivå (figur 4).
Det presenterade protokollet möjliggör mätningar av leverstyvhet av AFM oberoende av leveruppsamlingen, eftersom hela leverloberna inbäddade i OCT kan lagras under en längre period vid −80 °C. Men när vävnaden är snittad rekommenderar vi att du mäter proverna inom ~ 2 veckor eftersom vi har observerat en gradvis mjukning av vävnadssektioner som lagras under längre perioder (figur 5).
AFM utrustad med polarisationsmikroskopi gör det möjligt att exakt lokalisera intresseområdet inom leverlobulestrukturen. Det har dock också vissa begränsningar som måste beaktas vid tolkningen av resultaten. De styvhetsvärden som erhölls här mättes vid rumstemperatur. Vi antar att effekterna av temperatur på de mekaniska egenskaperna hos mjukvävnad kommer att vara små; Detta kan dock vara en av anledningarna till skillnader mellan de rapporterade in vivo-värdena för mekaniska egenskaper hos levervävnader och värdena i denna studie.
Dessutom tillåter detta protokoll AFM-analys av levervävnad i upp till 3 timmar, vilket kräver mild fixering av vävnaden. Den milda fixeringen av vävnadssektioner, liksom frys-upptiningscykeln, kommer sannolikt att påverka de absoluta värdena för Youngs modul. Således kan de rapporterade värdena för Youngs moduli skilja sig från in vivo-värden . Ytterligare studier behövs för att optimera protokollet för mätning av absoluta värden av Youngs modul från leversektioner, vilket kan uppnås med en annan metod för fixering av levervävnad64.
Icke desto mindre, Vi observerade ökande styvhet av kollagenrika områden i levern hos möss som behandlats med CCl4 för 3 veckor jämfört med 6 veckor. Sådana förändringar motsvarar fibrosprogression under långvarig skada (figur 4) och visar att relativa skillnader kan undersökas mellan olika behandlingar med hjälp av det presenterade protokollet. Detta överensstämmer med observationerna från Calò et al., som visade att milt fasta leversektioner visar liknande skillnader i styvhetsvärden mellan kollagenrika och kollagenfattiga områden som i färsk vävnad25.
Vi använde SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjäderkonstant ~ 0,09 N / m) modifierad med en sfärisk spets på 5,7 μm diameter för att minimera mekanisk störning av levervävnaden under mätningar. En pärla på 5,7 μm möjliggjorde tillräcklig indragning av provet för att undersöka dess styvhet samtidigt som dess integritet bevarades. En pärla med mindre diameter kan efter flera optimeringar användas för att få högre upplösning i styvhetskartorna men kan leda till ytterligare överskattning av Youngs modulvärden (för mer information, se Crichton et al.65). Med hjälp av den angivna cantilever-pärlensemblen kunde vi karakterisera provstyvhet i ett brett spektrum, från tiotals enheter av Pa till ~ 100 kPa.
Sneddons modell användes för att härleda Youngs modul från kraftkurvor, eftersom den möjliggör analys av djupa indragningar med kolloidala sonder62. Sneddons modell, till skillnad från Hertz modell, lider inte av begränsningen att kontaktradien måste vara mycket mindre än sfärradien. Det förutsätter vidare att provtjockleken är flera gånger större än indragningsdjupet 30,66. I den aktuella studien var indragningen ~ 2 μm med en pärlstorlek på 5,7 μm och en provtjocklek på 30 μm i kollagenrika områden; således var Sneddons modell lämplig. Andra modeller63 med tanke på vidhäftningskraften mellan spets och substrat kan användas för olika typer av vävnader.
Analys i AtomicJ implementerar korrigeringar för provernas ändliga tjocklek för att minimera bidraget från ett substrat samtidigt som Youngs modul62,67 härleds. I analysen av de erhållna kraftkurvorna använde vi ett enda Poissons förhållande på 0,45, vilket tidigare har rekommenderats för mjukvävnadsorgan24. Denna approximation har ingen signifikant effekt på beräknade värden på Youngs modul, eftersom förändringen i värdet på Poissons förhållande från 0,4 till 0,5 endast resulterar i en minskning med 0,893x av Youngs modulvärden beräknade enligt Sneddons ekvation. Med tanke på de flerfaldiga skillnaderna i Youngs modul mellan de olika varaktigheterna av CCl4-behandlingar är de fel som produceras genom att approximera Poissons förhållande endast marginella.
Vi använde abstinenskurvor för att beräkna styvhetsvärden, eftersom vi var intresserade av vävnadens elastiska respons på belastningen som tillhandahålls av cantilever snarare än i plastsvaret på indragning68. På grund av den viskoelastiska responsen hos mjukvävnaden kan passande uttagskurvor överskatta Youngs modul, vilket bör hållas i åtanke. Dessutom har vi observerat att dataanalys med inflygningskurvor ger liknande trender i styvhetsvärden mellan fibrotiska och kontrollområden, även om de absoluta värdena är motsvarande lägre (data visas inte).
När vi optimerade protokollet identifierade vi flera steg som var kritiska för mätningarnas reproducerbarhet. För det första är det viktigt att se till att pärlan är ungefär i mitten av den genomskinliga spetsen medan den fästs på utskjutaren. Detta förhindrar eventuell mekanisk obalans under indragning. För det andra, under leverfixering med PFA, är det nödvändigt att strikt följa tidsgränserna för upptining och fixering. Att ändra tidpunkten för detta steg kan allvarligt påverka de mekaniska egenskaperna hos vävnadssektioner. För det tredje måste utskjutaren kalibreras upprepade gånger med kontinuerlig övervakning och inmatning av samtidiga temperaturvärden för att undvika att artefakter uppstår i styvhetsvärden på grund av temperaturfluktuationer. Slutligen bör en enda leversektion inte mätas längre än 3 timmar från beredningen, eftersom överlagrad PBS kan avdunsta under längre perioder. Läsare kan hänvisa till felsökningstabellen (tabell 3) för att lösa problem som uppstått under AFM-mätningen, som också diskuteras i längd i Norman et al.46.
Tabell 3: Felsökningsguide. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Det presenterade protokollet möjliggör reproducerbar AFM-sondering av levervävnad. Det har potential att avslöja information om utveckling och eventuell regression av fibrotisk leversjukdom på mikroskopisk nivå och kan bidra till utvecklingen av terapier riktade mot fibrotiska ärrregioner som bildas under utvecklingen av kronisk leversjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Tjeckiens bidragsbyrå (18-02699S), den tjeckiska vetenskapsakademins institutionella forskningsprojekt (RVO 68378050) och MEYS CR-projektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, finansierat av MEYS CR infrastrukturprojekt LM2018127 och Europeiska regionala utvecklingsfonden-Project “UP CIISB” (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) gav ekonomiskt stöd till mätningarna vid CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Vi erkänner också Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien, som stöds av MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) och RVO: 68378050-KAV-NPUI, för deras stöd med mikroskopiavbildningen som presenteras häri.
AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
Cryotome | Leica | CM1950 | |
Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
AtomicJ v2.3.1 | |||
Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |