الخلايا الشحمية الفأرية المتمايزة في الثقافة الأولية: نموذج لمقاومة الأنسولين
Summary
يصف هذا البروتوكول عزل خلايا الفأر من الدهون تحت الجلد ، وتمايزها إلى خلايا دهنية ناضجة ، وتحريض مقاومة الأنسولين. يتم تقييم عمل الأنسولين عن طريق الفسفرة / تنشيط أعضاء مسار إشارات الأنسولين عبر اللطخة الغربية. تسمح هذه الطريقة بالتحديد المباشر لمقاومة / حساسية الأنسولين في الخلايا الشحمية الأولية.
Abstract
مقاومة الأنسولين هي تأثير منخفض للأنسولين على الخلايا المستهدفة ، وعادة ما يتم اشتقاقه من انخفاض إشارات مستقبلات الأنسولين. تساهم مقاومة الأنسولين في تطور مرض السكري من النوع 2 (T2D) وغيره من الأمراض المشتقة من السمنة ذات الانتشار المرتفع في جميع أنحاء العالم. لذلك ، فإن فهم الآليات الكامنة وراء مقاومة الأنسولين له أهمية كبيرة. تم استخدام العديد من النماذج لدراسة مقاومة الأنسولين في كل من الجسم الحي والمختبر. تمثل الخلايا الشحمية الأولية خيارا جذابا لدراسة آليات مقاومة الأنسولين وتحديد الجزيئات التي تتصدى لهذه الحالة والأهداف الجزيئية للأدوية التي تحسس الأنسولين. هنا ، أنشأنا نموذجا لمقاومة الأنسولين باستخدام الخلايا الشحمية الأولية في المزرعة المعالجة بعامل نخر الورم α (TNF-α).
يتم تمييز خلايا السلائف الشحمية (APCs) ، المعزولة من الأنسجة الدهنية تحت الجلد للفأر المهضومة بالكولاجيناز بواسطة تقنية فصل الخلايا المغناطيسية ، إلى خلايا دهنية أولية. ثم يتم تحفيز مقاومة الأنسولين عن طريق العلاج باستخدام TNF-α ، وهو سيتوكين التهابي يقلل من فسفرة التيروزين / تنشيط أعضاء سلسلة إشارات الأنسولين. يتم قياس انخفاض الفسفرة لمستقبلات الأنسولين (IR) ، وركيزة مستقبلات الأنسولين (IRS-1) ، وبروتين كيناز B (AKT) بواسطة اللطخة الغربية. توفر هذه الطريقة أداة ممتازة لدراسة الآليات التي تتوسط مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية.
Introduction
الأنسولين هو هرمون ابتنائي تنتجه خلايا β جزيرة البنكرياس والمنظم الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي للجلوكوز والدهون. من بين وظائفه العديدة ، ينظم الأنسولين امتصاص الجلوكوز ، وتخليق الجليكوجين ، وتكوين الجلوكوز ، وتخليق البروتين ، وتكوين الدهون ، وتحلل الدهون1. الإشارة الجزيئية الأولية بعد تفاعل الأنسولين مع مستقبلاته (IR) هي تنشيط نشاط كيناز بروتين التيروزين الجوهري ل IR2 ، مما يؤدي إلى الفسفرة الذاتية3 والتنشيط اللاحق لعائلة من البروتينات تعرف باسم ركائز مستقبلات الأنسولين (IRS) ، والتي ترتبط ببروتينات المحول مما يؤدي إلى تنشيط سلسلة من كينازات البروتين4 . ينشط الأنسولين مسارين رئيسيين للإشارات: فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K) – بروتين كيناز ب (AKT) وبروتين كيناز المنشط راس ميتوجين (MAPK). الأول يشكل نقطة فرع رئيسية أو عقدة 4,5 لتنشيط العديد من المستجيبات النهائية المشاركة في وظائف فسيولوجية متنوعة ، بما في ذلك تنظيم توازن الوقود ، في حين أن الأخير ينظم نمو الخلايا والتمايز 4,6. تعتمد إجراءات الأنسولين في النهاية على نوع الخلية والسياق الفسيولوجي7.
أحد الأنسجة الأيضية الرئيسية المستجيبة للأنسولين هو النسيج الدهني. الأنسجة الدهنية البيضاء هي أكثر أنواع الدهون وفرة في البشر والقوارض ، موزعة داخل الدهون تحت الجلد (بين الجلد والعضلات) والدهون الحشوية (حول الأعضاء في تجويف البطن). نظرا لحجمها الكبير ، فإن الخلايا الشحمية أو الخلايا الدهنية هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في الأنسجة الدهنية. يمكن أن تكون هذه الخلايا الدهنية بنية / بيج (مولد للحرارة) ، وردي (في الغدة الثديية) ، وأبيض 8,9. تحافظ الخلايا الشحمية البيضاء على احتياطيات الطاقة الرئيسية في الجسم في شكل دهون ثلاثية ، وهي عملية تعتمد على الأنسولين. يعزز الأنسولين نقل الجلوكوز وتكوين الدهون ، بينما يمنع تحلل الدهون أو انهيار الدهون 7,10. كما أنه يسهل تمايز الخلايا preadipocytes إلى الخلايا الشحمية – الخلايا الناضجة لتخزين الدهون11.
تحدث مقاومة الأنسولين عندما ينتج مستوى الأنسولين الطبيعي استجابة بيولوجية موهنة ، مما يؤدي إلى فرط الأنسولين في الدم التعويضي12. مقاومة الأنسولين هي حالة مرتبطة بزيادة الوزن والسمنة5 ، والتي عندما تؤدي مجتمعة إلى مرض السكري من النوع 2 (T2D) وأمراض التمثيل الغذائي الأخرى13. فرط الأنسولين في الدم يعوض مقاومة الأنسولين في الأنسجة المحيطية للحفاظ على مستويات الجلوكوز في الدم الطبيعية14. ومع ذلك ، فإن فقدان الخلايا β أو استنفادها في نهاية المطاف ، جنبا إلى جنب مع تفاقم مقاومة الأنسولين ، يؤدي إلى ارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم بما يتفق مع T2D5. لذلك ، يمكن أن تسهم مقاومة الأنسولين وفرط الأنسولين في الدم في تطور أمراض التمثيل الغذائي المشتقة من السمنة15. علاوة على ذلك ، قد تسبب السمنة التهابا موضعيا مزمنا منخفض الدرجة يعزز مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، تؤدي التغيرات المشتقة من السمنة في الأنسجة الدهنية ، مثل التليف والالتهاب وانخفاض تكوين الأوعية الدموية وتكوين الدهون ، إلى انخفاض مستويات مصل الأديبونيكتين (محسس الأنسولين) وزيادة إفراز عوامل مثل مثبط منشط البلازمينوجين 1 (PAI-1) ، والأحماض الدهنية الحرة ، والإكسوسومات في مجرى الدم ، مما يؤدي إلى تفاقم مقاومة الأنسولين17.
لا تزال العديد من الجوانب الكامنة وراء مقاومة الأنسولين غير معروفة. تم تطوير نماذج في المختبر وفي الجسم الحي لدراسة الآليات التي تتوسط مقاومة الأنسولين في الأنسجة المستهدفة الرئيسية ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية. تتمثل ميزة النماذج في المختبر في أن الباحثين لديهم سيطرة أكبر على الظروف البيئية ويمكنهم تقييم مقاومة الأنسولين في أنواع معينة من الخلايا. على وجه الخصوص ، تحتوي خلايا السلائف الشحمية (APCs) على النمط الظاهري الفردي لأنسجة المتبرع ، والتي قد تعكس علم وظائف الأعضاء بشكل أفضل من خطوط الخلايا الشحمية. العامل الرئيسي الذي يحفز مقاومة الأنسولين في المختبر هو عامل نخر الورم α (TNF-α). TNF-α هو سيتوكين التهابي تفرزه الخلايا الشحمية والبلاعم في الأنسجة الدهنية18. في حين أنه مطلوب لإعادة تشكيل الأنسجة الدهنية المناسبة وتوسيعها19 ، فإن التعرض طويل الأمد لعامل نخر الورم α يحفز مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية في الجسم الحي وفي الخلايا الشحمية في المختبر20. يؤدي العلاج المزمن α TNF-لعدة أنواع من الخلايا إلى زيادة فسفرة سيرين لكل من IR و IRS-1 ، وبالتالي تعزيز انخفاض فسفرة التيروزين21. زيادة فسفرة IRS-1 على بقايا سيرين يمنع نشاط الأشعة تحت الحمراء التيروزين كيناز وقد تكون واحدة من الآليات الرئيسية التي من خلالها العلاج المزمن TNF-α يضعف عمل الأنسولين22,23. ينشط TNF-α المسارات التي تتضمن مثبط سيرين / ثريونين كيناز للعامل النووي ĸB كيناز β (IKKβ) وكيناز محطة c-Jun N (JNK) 24. يحفز JNK برنامج نسخ التهابي معقد ولكن أيضا يفسفر مباشرة IRS-16.
أصبح فهم التسبب في مقاومة الأنسولين مهما بشكل متزايد لتوجيه تطوير العلاجات المستقبلية ضد T2D. أثبتت APCs أنها نموذج ممتاز لدراسة بيولوجيا الخلايا الدهنية ، بما في ذلك حساسية ومقاومة الأنسولين ، ولتحديد الخصائص الجوهرية للخلايا الشحمية بشكل مستقل عن البيئة الجهازية. يمكن الحصول على APCs بسهولة من مستودعات دهنية مختلفة ، وفي ظل الظروف المناسبة ، يتم تمييزها إلى خلايا دهنية ناضجة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تقييم التأثيرات المباشرة على مقاومة / حساسية الأنسولين في الخلايا الشحمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة طريقة لدراسة مقاومة الأنسولين التي تستخدم الخلايا الشحمية الأولية في المزرعة المعالجة بعامل نخر الورم α. يتميز هذا النموذج بأنه يمكن زراعة الخلايا الشحمية الأولية في ظل ظروف محددة لفترات طويلة من الزمن مع تحكم صارم في العوامل البيئية الخلوية26. مدة الفحص هي 15-2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر دانيال موندراغون، وأنطونيو برادو، وفرناندو لوبيز-باريرا، ومارتين غارسيا-سيرفين، وأليخاندرا كاستيلا، وماريا أنتونييتا كارباجو على مساعدتهم التقنية، وجيسيكا غونزاليس نوريس على تحريرها النقدي للمخطوطة. وحظي هذا البروتوكول بدعم المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في المكسيك، والصندوق القطاعي للبحوث في منحة التعليم 284771 (إلى ي. م).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
Riferimenti
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
