Differentierede museadipocytter i primær kultur: en model for insulinresistens
Summary
Denne protokol beskriver isoleringen af musepreadipocytter fra subkutant fedt, deres differentiering i modne adipocytter og induktionen af insulinresistens. Insulinvirkningen evalueres ved phosphorylering/aktivering af medlemmer af insulinsignalvejen gennem western blot. Denne metode muliggør direkte bestemmelse af insulinresistens/følsomhed i primære adipocytter.
Abstract
Insulinresistens er en reduceret virkning af insulin på dets målceller, normalt afledt af nedsat insulinreceptorsignalering. Insulinresistens bidrager til udviklingen af type 2-diabetes (T2D) og andre fedmeafledte sygdomme med høj forekomst på verdensplan. Derfor er forståelse af mekanismerne bag insulinresistens af stor relevans. Flere modeller er blevet brugt til at studere insulinresistens både in vivo og in vitro; Primære adipocytter repræsenterer en attraktiv mulighed for at studere mekanismerne for insulinresistens og identificere molekyler, der modvirker denne tilstand og de molekylære mål for insulinsensibiliserende lægemidler. Her har vi etableret en insulinresistensmodel ved hjælp af primære adipocytter i kultur behandlet med tumornekrosefaktor-α (TNF-α).
Adipocytprecursorceller (APC’er), isoleret fra kollaganasefordøjet musesubkutant fedtvæv ved magnetisk celleseparationsteknologi, differentieres til primære adipocytter. Insulinresistens induceres derefter ved behandling med TNF-α, et proinflammatorisk cytokin, der reducerer tyrosinphosphoryleringen / aktiveringen af medlemmer af insulinsignalkaskaden. Nedsat phosphorylering af insulinreceptor (IR), insulinreceptorsubstrat (IRS-1) og proteinkinase B (AKT) kvantificeres ved western blot. Denne metode giver et fremragende værktøj til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i fedtvæv.
Introduction
Insulin er et anabolsk hormon produceret af bugspytkirteløen β-celler og nøgleregulatoren for glukose- og lipidmetabolisme. Blandt dets mange funktioner regulerer insulin glukoseoptagelse, glykogensyntese, glukoneogenese, proteinsyntese, lipogenese og lipolyse1. Det indledende molekylære signal efter insulininteraktion med dets receptor (IR) er aktiveringen af den iboende tyrosinproteinkinaseaktivitet afIR2, hvilket resulterer i dets autophosphorylering3 og den efterfølgende aktivering af en familie af proteiner kendt som insulinreceptorsubstrater (IRS), som binder til adaptorproteiner, hvilket fører til aktivering af en kaskade af proteinkinaser4 . Insulin aktiverer to hovedsignalveje: phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-proteinkinase B (AKT) og Ras-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK). Førstnævnte udgør et vigtigt grenpunkt eller knude 4,5 til aktivering af adskillige downstream-effektorer, der er involveret i forskellige fysiologiske funktioner, herunder regulering af brændstofhomeostase, mens sidstnævnte regulerer cellevækst og differentiering 4,6. Insulinhandlinger afhænger i sidste ende af celletypen og den fysiologiske kontekst7.
Et af de vigtigste insulinresponsive metaboliske væv er fedtvævet. Hvidt fedtvæv er den mest rigelige type fedt hos mennesker og gnavere, fordelt inden for subkutant fedt (mellem hud og muskler) og visceralt fedt (omkring organerne i bughulen). På grund af deres store volumen er adipocytter eller fedtceller den mest rigelige celletype i fedtvæv. Disse fedtceller kan være brune/beige (termogene), lyserøde (i brystkirtlen) og hvide 8,9. Hvide adipocytter holder de vigtigste energireserver i kroppen i form af triglycerider, en insulinafhængig proces. Insulin fremmer glukosetransport og lipogenese, mens det hæmmer lipolyse eller lipidnedbrydning 7,10. Det letter også differentieringen af preadipocytter i adipocytter – de modne fedtlagrende celler11.
Insulinresistens opstår, når et normalt insulinniveau producerer et svækket biologisk respons, hvilket resulterer i kompenserende hyperinsulinæmi12. Insulinresistens er en tilstand forbundet med overvægt og fedme5, at når kombineret fører til type 2-diabetes (T2D) og andre metaboliske sygdomme13. Hyperinsulinæmi kompenserer insulinresistens i perifere væv for at opretholde normale blodsukkerniveauer14. Imidlertid fører eventuelt tab eller udmattelse af β celler sammen med forværret insulinresistens til forhøjede blodsukkerniveauer i overensstemmelse med T2D5. Derfor kan insulinresistens og hyperinsulinæmi bidrage til udviklingen af fedmeafledte metaboliske sygdomme15. Desuden kan fedme forårsage kronisk lavgradig lokal inflammation, der fremmer insulinresistens i fedtvæv15,16,17. Derudover fører fedmeafledte ændringer i fedtvæv, såsom fibrose, inflammation og reduceret angiogenese og adipogenese, til lavere adiponectinserumniveauer (et insulinsensibilisator) og øget sekretion af faktorer såsom plasminogenaktivatorhæmmer 1 (PAI-1), frie fedtsyrer og eksosomer i blodbanen, hvilket forværrer insulinresistens17.
Mange aspekter af insulinresistens forbliver ukendte. In vitro og in vivo modeller er blevet udviklet til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i større målvæv, herunder fedtvæv. Fordelen ved in vitro-modeller er, at forskerne har mere kontrol over miljøforholdene og kan vurdere insulinresistens i specifikke celletyper. Især har adipocytprecursorceller (APC’er) donorvævets individuelle fænotype, hvilket kan afspejle fysiologi bedre end adipocytcellelinjer. En hovedfaktor, der inducerer insulinresistens in vitro, er tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α er et proinflammatorisk cytokin udskilt af adipocytter og makrofager i fedtvæv18. Mens det er nødvendigt for korrekt fedtvæv remodellering og ekspansion19, langvarig eksponering for TNF-α inducerer insulinresistens i fedtvæv in vivo og i adipocytter in vitro20. Kronisk TNF-α behandling af flere celletyper fører til øget serinphosphorylering af både IR og IRS-1 og derved fremmer nedsat tyrosinphosphorylering21. Øget phosphorylering af IRS-1 på serinrester hæmmer IR-tyrosinkinaseaktiviteten og kan være en af de vigtigste mekanismer, hvormed kronisk TNF-α-behandling forringer insulinvirkningen22,23. TNF-α aktiverer veje, der involverer serin/threoninkinasehæmmeren af kernefaktor ĸB-kinase β (IKKβ) og c-Jun N terminalkinase (JNK)24. JNK inducerer et komplekst proinflammatorisk transkriptionsprogram, men også direkte phosphorylater IRS-16.
Forståelse af patogenesen af insulinresistens er blevet stadig vigtigere for at styre udviklingen af fremtidige terapier mod T2D. APC’er har vist sig at være en fremragende model til undersøgelse af fedtcellebiologi, herunder følsomhed og resistens over for insulin, og til identifikation af de iboende egenskaber ved adipocytter uafhængigt af det systemiske miljø. APC’er kan let opnås fra forskellige fedtdepoter og under passende betingelser differentieres til modne adipocytter. Med denne metode kan direkte virkninger på insulinresistens/følsomhed evalueres i adipocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir giver en metode til undersøgelse af insulinresistens, der bruger primære adipocytter i kultur behandlet med TNF-α. Denne model har den fordel, at primære adipocytter kan dyrkes under definerede betingelser i lange perioder med en stram kontrol af cellulære miljøfaktorer26. Assayvarigheden er 15-20 dage, selvom variationer i procentdelen af differentierede adipocytter kan forekomme mellem eksperimenter. Primære adipocytter har fordele i forhold til cellelinjer, da de ikke kontinu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla og María Antonieta Carbajo for deres tekniske assistance og Jessica Gonzalez Norris for kritisk redigering af manuskriptet. Denne protokol blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (til Y.M.).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
Riferimenti
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
