Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline
Summary
Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.
Abstract
La résistance à l’insuline est un effet réduit de l’insuline sur ses cellules cibles, généralement dérivé d’une diminution de la signalisation des récepteurs de l’insuline. La résistance à l’insuline contribue au développement du diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies dérivées de l’obésité à forte prévalence dans le monde entier. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la résistance à l’insuline est d’une grande pertinence. Plusieurs modèles ont été utilisés pour étudier la résistance à l’insuline in vivo et in vitro; Les adipocytes primaires représentent une option intéressante pour étudier les mécanismes de la résistance à l’insuline et identifier les molécules qui contrecarrent cette condition et les cibles moléculaires des médicaments sensibilisants à l’insuline. Ici, nous avons établi un modèle de résistance à l’insuline en utilisant des adipocytes primaires en culture traités avec le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α).
Les cellules précurseurs adipocytaires (APC), isolées du tissu adipeux sous-cutané de souris digéré par collagéase par la technologie de séparation cellulaire magnétique, sont différenciées en adipocytes primaires. La résistance à l’insuline est ensuite induite par un traitement au TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire qui réduit la phosphorylation / activation de la tyrosine des membres de la cascade de signalisation de l’insuline. La diminution de la phosphorylation du récepteur de l’insuline (IR), du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1) et de la protéine kinase B (AKT) est quantifiée par transfert Western. Cette méthode fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux.
Introduction
L’insuline est une hormone anabolique produite par les β-cellules des îlots pancréatiques et le régulateur clé du métabolisme du glucose et des lipides. Parmi ses nombreuses fonctions, l’insuline régule l’absorption du glucose, la synthèse du glycogène, la gluconéogenèse, la synthèse des protéines, la lipogenèse et la lipolyse1. Le signal moléculaire initial après interaction de l’insuline avec son récepteur (IR) est l’activation de l’activité intrinsèque de la protéine tyrosine kinase de l’IR2, entraînant son autophosphorylation3 et l’activation ultérieure d’une famille de protéines connues sous le nom de substrats des récepteurs de l’insuline (PID), qui se lie aux protéines adaptatrices conduisant à l’activation d’une cascade de protéines kinases4 . L’insuline active deux voies de signalisation principales: la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protéine kinase B (AKT) et la protéine kinase activée par Ras-mitogène (MAPK). Le premier constitue un point de branche ou nœud majeur 4,5 pour l’activation de nombreux effecteurs en aval impliqués dans diverses fonctions physiologiques, y compris la régulation de l’homéostasie du carburant, tandis que le second régule la croissance et la différenciation cellulaires 4,6. Les actions de l’insuline dépendent en fin de compte du type cellulaire et du contexte physiologique7.
L’un des principaux tissus métaboliques sensibles à l’insuline est le tissu adipeux. Le tissu adipeux blanc est le type de graisse le plus abondant chez les humains et les rongeurs, distribué dans la graisse sous-cutanée (entre la peau et les muscles) et la graisse viscérale (autour des organes de la cavité abdominale). Compte tenu de leur grand volume, les adipocytes ou cellules graisseuses sont le type de cellule le plus abondant dans le tissu adipeux. Ces cellules graisseuses peuvent être brunes/beiges (thermogéniques), roses (dans la glande mammaire) et blanches 8,9. Les adipocytes blancs conservent les principales réserves d’énergie dans le corps sous forme de triglycérides, un processus insulino-dépendant. L’insuline favorise le transport du glucose et la lipogenèse, tout en inhibant la lipolyse ou la dégradation des lipides 7,10. Il facilite également la différenciation des préadipocytes en adipocytes – les cellules matures stockant les graisses11.
La résistance à l’insuline se produit lorsqu’un taux d’insuline normal produit une réponse biologique atténuée, entraînant une hyperinsulinémie compensatoire12. La résistance à l’insuline est une affection associée au surpoids et à l’obésité5 qui, lorsqu’elle est combinée, entraîne le diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies métaboliques13. L’hyperinsulinémie compense la résistance à l’insuline dans les tissus périphériques pour maintenir une glycémie normale14. Cependant, la perte ou l’épuisement éventuel de cellules β, ainsi qu’une résistance exacerbée à l’insuline, entraînent une glycémie élevée compatible avec le DT25. Par conséquent, la résistance à l’insuline et l’hyperinsulinémie peuvent contribuer au développement de maladies métaboliques dérivées de l’obésité15. En outre, l’obésité peut provoquer une inflammation locale chronique de bas grade favorisant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux15,16,17. En outre, les altérations du tissu adipeux dérivées de l’obésité, telles que la fibrose, l’inflammation et la réduction de l’angiogenèse et de l’adipogenèse, entraînent une baisse des taux sériques d’adiponectine (un sensibilisant à l’insuline) et une augmentation de la sécrétion de facteurs tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1 (PAI-1), les acides gras libres et les exosomes dans la circulation sanguine, exacerbant la résistance à l’insuline17.
De nombreux aspects sous-jacents à la résistance à l’insuline restent inconnus. Des modèles in vitro et in vivo ont été développés pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans les principaux tissus cibles, y compris le tissu adipeux. L’avantage des modèles in vitro est que les chercheurs ont plus de contrôle sur les conditions environnementales et peuvent évaluer la résistance à l’insuline dans des types cellulaires spécifiques. En particulier, les cellules précurseurs adipocytaires (APC) ont le phénotype individuel du tissu donneur, ce qui pourrait mieux refléter la physiologie que les lignées cellulaires adipocytes. L’un des principaux facteurs induisant la résistance à l’insuline in vitro est le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les adipocytes et les macrophages dans le tissu adipeux18. Bien qu’elle soit nécessaire pour un remodelage et une expansion appropriés du tissu adipeux19, l’exposition à long terme au TNF-α induit une résistance à l’insuline dans le tissu adipeux in vivo et dans les adipocytes in vitro20. Le traitement chronique par le TNF-α de plusieurs types cellulaires entraîne une augmentation de la phosphorylation de la sérine de l’IR et de l’IRS-1, favorisant ainsi une diminution de la phosphorylation de la tyrosine21. L’augmentation de la phosphorylation de l’IRS-1 sur les résidus de sérine inhibe l’activité de la tyrosine kinase IR et peut être l’un des principaux mécanismes par lesquels le traitement chronique par le TNF-α altère l’action de l’insuline22,23. Le TNF-α active des voies impliquant l’inhibiteur de la sérine/thréonine kinase du facteur nucléaire ĸB kinase β (IKKβ) et de la kinase terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induit un programme transcriptionnel pro-inflammatoire complexe mais phosphoryle aussi directement IRS-16.
Comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline est devenu de plus en plus important pour guider le développement de futures thérapies contre le DT2. Les APC se sont révélés être un excellent modèle pour l’étude de la biologie des cellules adipeuses, y compris la sensibilité et la résistance à l’insuline, et pour identifier les propriétés intrinsèques des adipocytes indépendamment de l’environnement systémique. Les APC peuvent être facilement obtenus à partir de différents dépôts adipeux et, dans les conditions appropriées, différenciés en adipocytes matures. Avec cette méthode, les effets directs sur la résistance / sensibilité à l’insuline peuvent être évalués dans les adipocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article fournit une méthode pour étudier la résistance à l’insuline qui utilise des adipocytes primaires dans la culture traitée avec le TNF-α. Ce modèle présente l’avantage que les adipocytes primaires peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant de longues périodes avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires26. La durée du test est de 15 à 20 jours, bien que des variations dans le pourcentage d’adipocytes différenciés puissent se pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla et María Antonieta Carbajo pour leur assistance technique, et Jessica Gonzalez Norris pour l’édition critique du manuscrit. Ce protocole a été soutenu par Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (à Y.M.).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
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